Summary

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

このよう小頭症など人間の神経発達障害は、不十分にしかによる人間の脳は、拡張された皮質表面、ヒト以外の動物は異なる独特の特徴を持っているという事実のために、動物モデルで研究することができます。

この局面は、 インビトロ細胞培養系では 、人間の脳の発達に十分に2Dで研究することができない複雑なプロセスになります。新興3D培養技術は、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から組織様オルガノイドの生成を可能にします。 3D懸濁培養における多能性幹細胞のインビトロ分化は、組織化、層状組織1、2、3を生じさせる、タイムリーかつ領域特異的な様式で種々の細胞型を形成することができます。 3D培養技術を開拓し、幹細胞から始まる、器官形成の複雑さを詳解研究所のおかげで、私たちは、人間の脳の発達の初期事象を描写すると試験管 1、2、3 小頭症をモデル化するために、脳のオルガノイドを生成する強力な方法を開発しました。我々がランカスターによって開発されたオリジナルの方法を適応することを注目すべきです脳オルガノイド1を生成します。この方法は、我々の実験の要件に応じて変更されました。

ガブリエルから研究の目的脳の発達中の神経幹細胞の維持の細胞および分子メカニズムを分析することでした。これを行うためには、機械的な研究は、小頭症患者4由来の3D脳オルガノイドにおける神経前駆細胞(NPCの)を分析することにより行いました。この患者はCPAP、中心体の生合成に必要な5保存された中心体タンパク質に変異を運びました。広く受け入れられているハイポ論文は、小頭は、NPCのプールの枯渇の結果であり、これは、細胞死または早期分化1、6、7、8、9のいずれかに起因するかもしれないということです。

小頭脳オルガノイドの心室ゾーン(VZS)を分析することによって、それはのNPCのかなりの数は、健康なドナー4に由来する脳オルガノイドは異なり、非対称細胞分裂を受けることが示されました。小頭脳オルガノイドの広範な顕微鏡および生化学的解析は、タイムリーな繊毛分解4におけるCPAPのための予想外の役割を明らかにしました。具体的には、突然変異したCPAPは遅繊毛の分解に関連しているとのNPC 4の早期分化につながる、再入細胞周期を遅らせました。これらの結果は、小頭と目における繊毛の役割を示唆します神経発生と脳のサイズ制御10時のEIR関与。

このプロトコルの最初の部分は、均質脳オルガノイドを生成するための三段階法の説明です。前に述べたように、オリジナルのランカスタープロトコルが適応と我々の目的1に合わせて変更されました。まず、人間性IPSCは、エンゲル・ホルム – スウォーム(EHS)マトリックス上に定義された無フィーダー条件で培養します。このステップは、フィーダ依存性多能性幹細胞培養物の変動を回避します。このプロトコルでは、神経上皮を形成するために神経分化の誘導性IPSCから直接始まります。胚様体(EB)形成工程、より制御および指向様式で神経分化進行をスキップし。このアプローチは、中胚葉および内胚葉のような他の胚細胞層の自発的および無向形成を制限します。このプロトコルを適用することにより、神経のロゼットを含むニューロスフェアは、EHのために5日目に収穫することができますS行列の埋め込み静止懸濁培養。我々のプロトコルの第三の工程のために使用オルガノイド媒体はドルソモルフィンおよびSB431542が補充されます。ドルソモルフィンは、骨形成タンパク質(BMP)の小分子阻害剤であり、SB431542はTGFβ/アクチビン/ノーダルシグナル伝達経路を阻害します。これらの要因の組み合わせが神経分化よりも効率的に単独で11、12、13、14、レチノイン酸を促進し得ます。

要するに、これらの修飾は、オルガノイドを横切る最小の変動で、脳オルガノイドの再現可能な生成を可能にします。重要なことは、この方法が確実に中心体および細胞周期のダイナミクスに影響を与える遺伝子の変異を運ぶ患者性IPSC、から小頭脳オルガノイドを生成するために適用されました。

このプロトコルの第2の部分は、BRを調製するための指示を与えます小頭内の細胞の欠陥の分析と解釈のためにAINのオルガノイド。これは固定、凍結切片、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡分析を含んでいます。このプロトコルは、期待される結果の詳細な説明とし、解釈のためのガイダンスを読者に提供します。

Protocol

脳オルガノイドの1世代(23日) 神経外胚葉の開始(5日) 注:以下の点は、分化の開始前に検討すべきです。ヒトiPS細胞を得るための再プログラミング方法(lentiviral-、仙台ウィルス、エピソーム、またはマイクロRNAベースなど ) は 、理想的には、全ての患者に対して同じであるとのiPSCラインを制御しなければなりません。公開されたプロトコルに基…

Representative Results

脳オルガノイドの生成は、連続培養( 図1A)の少なくとも三週間を要します。再現性のある結果を達成するために、我々は、研究者は、すべてのステップを文書化して、重要なのは、培地成分、時刻、およびセルの取り扱いに関するあらゆる変更を回避することをお勧めします。ここでは、重要なマイルストーンは、実験の終了時に十分な品質のオルガ?…

Discussion

MCPHは、in vivoまたはin vitroでの単純なヒト細胞培養アプローチに動物モデルで再現されることができない複雑なヒト神経発達障害です。 MCPHの臨床症状は、早期の神経発生が開始されると、最初の学期中に現れ始めます。このように、3D脳オルガノイドはMCPH開発をモデル化するための信頼性の高い実験系を表します。また、3Dヒト脳オルガノイドは重要なこと、iii)は、様?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、フリッツ・ティッセン財団(Az.10.14.2.152)によってサポートされていました。私たちは、組織の埋め込み施設とCMMCの顕微鏡中核施設に感謝しています。私たちは、中心体および細胞骨格生物学研究所のメンバーが提供する議論と技術サポートのために感謝しています。私たちは、原稿を校正するために李明グーイに感謝します。

Materials

Anti-mouse 488 Invitrogen A-11001 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647 Invitrogen A-21245 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b proteintech 17711-1-AP ARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN system IBS Integra Bioscience 183001
DAPI Sigma-Aldrich, US 32670 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12 Gibco, US 31331093 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
Dorsomorphin Sigma-Aldrich, US P5499 Compound C; multiple suppliers
Embedding medium AppliChem A9011, 0100 Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix Corning 354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin  Sigma-Aldrich, US G7765-250ML Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C
Glycine AppliChem A1067,1000 Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) Sigma Aldrich, US BR452201-1000EA multiple suppliers 
Insulin Sigma-Aldrich, US I3536-100MG multiple suppliers
L-glutamine Gibco, US 25030081 L-glutamine (200 mM)
Medium A Stem cell technologies #05850 mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B Stem cell technologies #05835 Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C Gibco, US 21103049 Neural Basal Medium
MEM Gibco, US 11140035 MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza, Switzerland #LT07-218 Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin Novus biologicals NBP1-92717 Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA) AppliChem A3813, 0500 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tablets Gibco, US 18912014 See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) Gibco, US 15140122 Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL) Sigma-Aldrich, US P8920-100ML Multiple suppliers
pVim MBL D076-3S Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A  Stem cell technologies # 05872 Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B  Sigma-Aldrich, US A6964-100ML Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 S Leica biosystems CM3050 S Multiple suppliers
SB431542 Selleckchem.com S1067 Multiple suppliers
Spinner flask 250 ml IBS Integra Bioscience 182026
Sucrose AppliChem A4734, 1000 Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides Thermo scientific, US J3800AMNZ Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1 Gibco, US 17502048 N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A Gibco, US 12587010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold Sakura, NL 4565 Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura, NL 4583 Multiple suppliers
Triton X-100 AppliChem A1388,0500 Multiple suppliers multiple suppliers
TUJ1 Sigma-Aldrich, US T2200 β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay Promega, US G3250 DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology AppliChem A4974,0500 Multiple suppliers
waterproof sheet BEMIS company, inc. PM996 Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632  Selleckchem.com S1049 ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol Gibco, US 31350010 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

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Cite This Article
Gabriel, E., Gopalakrishnan, J. Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (122), e55372, doi:10.3791/55372 (2017).

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