Menselijke neurologische stoornissen, zoals microcefalie, kan slechts slecht worden bestudeerd in diermodellen vanwege het feit dat de menselijke hersenen een verlengd corticale oppervlak, een unieke eigenschap die verschilt van niet-humane dieren.

Dit aspect maakt de ontwikkeling van menselijke hersenen een complex proces dat niet voldoende kan worden onderzocht in een 2D in vitro celcultuur. Opkomst 3D kweektechnieken kan de vorming van weefselachtige organoids van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De in vitro differentiatie van pluripotente stamcellen in een 3D suspensiekweek maakt de vorming van verschillende celtypen tijdig en regiospecifieke wijze, hetgeen leidt tot een georganiseerde, gelaagd weefsel ^{1, 2, 3.} Met dank aan laboratoria die 3D-cultuur technologieën pionier en gedemystificeerd de complexiteit van de formatie orgel, uitgaande van stamcellen,ontwikkelden we een robuuste werkwijze voor het genereren hersenen organoids vroege gebeurtenissen van ontwikkeling van menselijke hersenen af te bakenen en microcefalie model in vitro ^{1, 2, 3.} Het is opmerkelijk dat we pasten de originele methode ontwikkeld door Lancaster et al. cerebrale organoids ¹ genereren. Deze werkwijze werd gemodificeerd volgens onze experimentele eisen.

Het doel van een studie van Gabriel et al. was om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurale stamcellen onderhoud te analyseren tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Om dit te doen, werd een mechanistische onderzoek uitgevoerd door het analyseren van neurale progenitorcellen (NPC) in 3D hersenen organoids afgeleid van een microcefalie patiënt ^4. Deze patiënt had een mutatie in CPAP, een geconserveerd centrosomal proteïne noodzakelijk voor centrosome biogenese ^5. Een algemeen aanvaard hypostelling is dat microcefalie is het gevolg van een afname van het NPC pool en dit zou te wijten ofwel celdood of differentiatie voortijdige ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Door het analyseren van de ventriculaire zone (VZS) van microcefalie hersenen organoids werd aangetoond dat een aanzienlijk aantal NPC ondergaan asymmetrische celdeling, anders dan de hersenen organoids verkregen uit een gezonde donor ^4. Uitgebreide microscopische en biochemische analyses van microcefalie hersenen organoids onthulde een onverwachte rol voor de CPAP in tijdig cilia demontage ^4. Specifiek wordt gemuteerd CPAP gekoppeld aan achtergebleven cilium demontage en vertraagde celcyclus opnieuw binnenkomen, wat leidt tot voortijdige differentiatie van NPC ^4. Deze resultaten suggereren een rol voor cilia in microcefalie en thEIR betrokkenheid tijdens de neurogenese en de omvang van de hersenen controle ^10.

Het eerste deel van dit protocol is een beschrijving van een drietrapsmethode homogene hersenen organoids genereren. Zoals eerder vermeld, is de oorspronkelijke Lancaster protocol aangepast en gemodificeerd om ons doel passen ^1. Eerst, menselijke iPSCs gekweekt in een gedefinieerde toestand als feeder-on Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix. Deze stap vermijdt de variaties van feeder-afhankelijke pluripotente stamcel cultures. In dit protocol, het induceren van neuronale differentiatie onder vorming neurale epitheel begint direct vanuit iPSCs. Sla de embryoiden lichaam (EB) vormingsstap, het neurale differentiatie verloopt in een gecontroleerde en gerichte wijze. Deze aanpak beperkt de spontane en ongestuurde vorming van andere kiemcellen lagen, zoals mesoderm en endoderm. Door toepassing van dit protocol kunnen neurosferen die neurale rozetten worden geoogst op dag 5 EHS matrix inbedden en stationaire suspensiekweek. De organoïde medium dat voor de derde stap van ons protocol is aangevuld met dorsomorphin en SB431542. Dorsomorphin is een klein molecuul remmer van botmorfogeenproteïne (BMP) en SB431542 remt de TGF / activine / nodale signaalroute. De combinatie van deze factoren kunnen neurale differentiatie efficiënter dan retinezuur alleen ^{11, 12, 13, 14} te bevorderen.

In totaal hebben deze modificaties maken de reproduceerbare vorming van hersenen organoids met minimale verschillen tussen organoids. Belangrijk is dat deze werkwijze toegepast op robuuste genereren microcefalie hersenen organoids van patiënt iPSCs die mutaties dragen in genen die centrosomes en celcyclus dynamica beïnvloeden.

Het tweede deel van dit protocol geeft instructies aan br voorbereidingain organoids voor de analyse en interpretatie van de cellulaire defecten in microcefalie. Dit omvat fixatie, cryosectioning, immunofluorescentie kleuring en confocale microscopische analyse. Dit protocol zal de lezer te voorzien van een gedetailleerde beschrijving van de verwachte resultaten en onder begeleiding voor interpretatie.