Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Menschliche Entwicklung des Nervenstörungen, wie Mikrozephalie, nur schlecht in Tiermodellen untersucht werden, aufgrund der Tatsache, dass das menschliche Gehirn haben eine erweiterte kortikalen Oberfläche, ein einzigartiges Merkmal der sich von nicht-menschlichen Tieren.

Dieser Aspekt macht die menschliche Entwicklung des Gehirns einen komplexen Prozess, der nicht ausreichend in einem 2D untersucht werden, in vitro Zellkultursystem. Schwellen 3D-Kulturtechniken ermöglichen die Erzeugung von gewebeähnlichen Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Die in – vitro – Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in einer 3D – Suspensionskultur ermöglicht die Bildung von verschiedenen Zelltypen in einer angemessenen und regionsspezifische Weise, was zu einem organisierten, geschichteten Gewebe ^{1, 2, 3.} Dank Laboratorien, die 3D-Kulturtechnologien Pionierarbeit geleistet und die Komplexität der Organbildung entmystifiziert, aus Stammzellen beginnen,entwickeln wir eine robuste Methode Gehirn Organoide der Erzeugung frühe Ereignisse der menschlichen Gehirn Entwicklung zu beschreiben und Mikrozephalie in vitro ^{1, 2, 3} zu modellieren. Es ist bemerkenswert , dass wir die ursprüngliche Methode , entwickelt von Lancaster et al angepasst. zerebrale Organoide ¹ zu erzeugen. Diese Methode wurde nach unseren experimentellen Anforderungen modifiziert.

Das Ziel einer Studie von Gabriel et al. war die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Stammzell Wartung während der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Um dies zu tun, wurde eine mechanistische Studie durch die Analyse von neuralen Vorläuferzellen (NSC) in 3D durchgeführt Gehirn Organoide von einem Patienten stammte Mikrocephalie ^4. Dieser Patient trug eine Mutation in CPAP, ein konserviertes Protein zentrosomalen für Zentrosom Biogenese ⁵ erforderlich. Eine weithin akzeptierte hypoThese ist , dass Mikrocephalie das Ergebnis einer Erschöpfung des NPC – Pools ist, und dies könnte entweder zum Zelltod oder zu einem vorzeitigen Differenzierung ^{1, 6, 7, 8, 9} liegt.

Durch die Analyse der ventrikulären Zonen (VZs) von Mikrocephalie brain Organoiden, wurde gezeigt , dass eine beträchtliche Anzahl von NSC asymmetrischer Zellteilung zu unterziehen, im Gegensatz zu Gehirn Organoide von einem gesunden Spender stamm ^4. Umfangreiche mikroskopische und biochemische Analysen von microcephalic Gehirn Organoide ergab eine unerwartete Rolle für CPAP in rechtzeitige Zilien Demontage ^4. Insbesondere mutierte CPAP mit retardierten cilium Demontage- und verzögerte Zellzyklus – Wiedereintritt verbunden ist , auf die Differenzierung von vorzeitiger NSC führenden ^4. Diese Ergebnisse legen nahe, eine Rolle für Zilien in Mikrozephalie und thEIR Beteiligung während der Neurogenese und Gehirngröße Kontrolle ^10.

Der erste Teil dieses Protokolls ist eine Beschreibung eines dreistufigen Verfahrens homogene brain Organoiden zu erzeugen. Wie bereits erwähnt, wurde das ursprüngliche Lancaster Protokoll angepasst und modifiziert unser Ziel ¹ zu entsprechen. Erstens sind menschliche iPSCs Kultur in einem definierten feeder freien Zustand auf Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix. Dieser Schritt vermeidet die Variationen von Feeder-abhängigen pluripotenten Stammzellkulturen. In diesem Protokoll zur Induktion neuronaler Differenzierung zu bilden direkt von iPSCs neuralen Epithel beginnt. Durch den Embryoidkörper (EB) Bildungsschritt übersprungen, die neurale Differenzierung erfolgt in einer kontrollierteren und Weise gerichtet. Dieser Ansatz begrenzt die spontane und ungerichteten Bildung anderer Keimzellschichten, wie Mesoderm und Endoderm. Durch dieses Protokoll anwenden, können Neurosphären neuronale Rosetten enthalten am Tag geerntet werden 5 für EHS-Matrix und Einbettung stationäre Suspensionskultur. Das organoiden Medium für den dritten Schritt unseres Protokolls verwendet wird mit Dorsomorphin und SB431542 ergänzt. Dorsomorphin ist ein niedermolekularer Inhibitor von knochenmorphogenes Protein (BMP) und SB431542 hemmt die TGF & bgr; / Activin / Knoten Signalweg. Die Kombination dieser Faktoren könnte neuronale Differenzierung mehr fördert effizienter als Retinsäure allein ^{11, 12, 13, 14.}

Insgesamt ermöglichen diese Modifikationen die reproduzierbare Erzeugung von brain Organoide mit minimalen Variationen in Organoiden. Wichtig ist, dass diese Methode microcephalic Gehirn Organoide von Patienten zu iPSCs robust erzeugt aufgebracht, die Mutationen in Genen tragen, die Zentrosomen und Zellzyklusdynamik beeinflussen.

Der zweite Teil dieses Protokolls gibt Anweisungen br vorzubereitenain Organoide für die Analyse und Interpretation von zellulären Defekte in Mikrozephalie. Dazu gehören Fixierung, Kryoschneiden, Immunofluoreszenzfärbung und konfokale mikroskopische Analyse. Dieses Protokoll wird dem Leser eine detaillierte Beschreibung der erwarteten Ergebnisse liefern und mit Anleitung zur Interpretation.