Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani.
Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato 1, 2, 3. Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro 1, 2, 3. È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali 1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali.
L'obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia 4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome 5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce 1, 6, 7, 8, 9.
Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano 4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia 4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC 4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo 10.
La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo 1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l'induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all'acido retinoico solo 11, 12, 13, 14.
Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare.
La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l'analisi e l'interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l'interpretazione.
MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Siamo grati alla struttura del tessuto embedding e la struttura di base del microscopio di CMMC. Siamo grati per le discussioni e il supporto tecnico forniti dai membri del Laboratorio per Centrosome e citoscheletro Biology. Ringraziamo Li Ming Gooi per la correzione delle bozze del manoscritto.
Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |