Summary

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos.

Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada 1, 2, 3. Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais 1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais.

O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia 4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma 5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce 1, 6, 7, 8, 9.

Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável 4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem 4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs 4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle 10.

A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho 11, 12, 13, 14.

Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular.

A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.

Protocol

1. Geração de Cérebro Organóides (23 dias) Iniciação de neuroectoderme (5 dias) Nota: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (lentiviral- etc, à base de microARN Sendai-a vírus, episomal-, OR) para obter iPSCs humanos devem, idealmente, ser o mesmo para todos os pacientes e controlar linhas IPSC. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis <sup…

Representative Results

A geração de Organóides cerebrais requer pelo menos três semanas de cultura contínua (Figura 1A). Para conseguir resultados reproduzíveis, recomendamos que o pesquisador documenta cada passo e, sobretudo, evita quaisquer alterações em relação componentes do meio, pontos de tempo e manipulação de célula. Aqui, damos um resumo de como avaliar se marcos críticos são atingidos a fim de obter Organóides de qualidade suficiente no final do experimento. A forma?…

Discussion

MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Somos gratos à facilidade de incorporação do tecido e da instalação do núcleo microscópio de CMMC. Estamos gratos pelas discussões e suporte técnico fornecido pelos membros do Laboratório de centrossoma e citoesqueleto Biology. Agradecemos Li Ming Gooi pela revisão do manuscrito.

Materials

Anti-mouse 488 Invitrogen A-11001 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647 Invitrogen A-21245 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b proteintech 17711-1-AP ARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN system IBS Integra Bioscience 183001
DAPI Sigma-Aldrich, US 32670 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12 Gibco, US 31331093 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
Dorsomorphin Sigma-Aldrich, US P5499 Compound C; multiple suppliers
Embedding medium AppliChem A9011, 0100 Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix Corning 354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin  Sigma-Aldrich, US G7765-250ML Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C
Glycine AppliChem A1067,1000 Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) Sigma Aldrich, US BR452201-1000EA multiple suppliers 
Insulin Sigma-Aldrich, US I3536-100MG multiple suppliers
L-glutamine Gibco, US 25030081 L-glutamine (200 mM)
Medium A Stem cell technologies #05850 mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B Stem cell technologies #05835 Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C Gibco, US 21103049 Neural Basal Medium
MEM Gibco, US 11140035 MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza, Switzerland #LT07-218 Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin Novus biologicals NBP1-92717 Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA) AppliChem A3813, 0500 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tablets Gibco, US 18912014 See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) Gibco, US 15140122 Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL) Sigma-Aldrich, US P8920-100ML Multiple suppliers
pVim MBL D076-3S Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A  Stem cell technologies # 05872 Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B  Sigma-Aldrich, US A6964-100ML Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 S Leica biosystems CM3050 S Multiple suppliers
SB431542 Selleckchem.com S1067 Multiple suppliers
Spinner flask 250 ml IBS Integra Bioscience 182026
Sucrose AppliChem A4734, 1000 Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides Thermo scientific, US J3800AMNZ Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1 Gibco, US 17502048 N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A Gibco, US 12587010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold Sakura, NL 4565 Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura, NL 4583 Multiple suppliers
Triton X-100 AppliChem A1388,0500 Multiple suppliers multiple suppliers
TUJ1 Sigma-Aldrich, US T2200 β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay Promega, US G3250 DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology AppliChem A4974,0500 Multiple suppliers
waterproof sheet BEMIS company, inc. PM996 Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632  Selleckchem.com S1049 ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol Gibco, US 31350010 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

References

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Cite This Article
Gabriel, E., Gopalakrishnan, J. Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (122), e55372, doi:10.3791/55372 (2017).

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