Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos.
Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada 1, 2, 3. Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais 1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais.
O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia 4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma 5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce 1, 6, 7, 8, 9.
Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável 4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem 4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs 4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle 10.
A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho 11, 12, 13, 14.
Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular.
A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.
MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Somos gratos à facilidade de incorporação do tecido e da instalação do núcleo microscópio de CMMC. Estamos gratos pelas discussões e suporte técnico fornecido pelos membros do Laboratório de centrossoma e citoesqueleto Biology. Agradecemos Li Ming Gooi pela revisão do manuscrito.
Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |