desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos.

Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada ^{1, 2, 3.} Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro ^{1, 2, 3.} É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais ^1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais.

O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia ^4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma ^5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável ^4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem ^4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs ^4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle ^10.

A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a ^uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho ^{11, 12, 13, 14.}

Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular.

A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.