הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

פרעות התפתחותיות אדם, כגון ממיקרוצפלוס-, ניתן ללמוד בצורה גרועה רק במודלים של בעלי חיים בשל העובדה כי מוח האנושי יש משטח קליפת מוח מורחב, תכונה ייחודית ושונת חיות לא אנושיות.

היבט זה עושה התפתחות המוח האנושי תהליך מורכב כי לא ניתן ללמוד מספיק בתוך 2D, במערכת תרבית תאים במבחנה. מתעוררים טכניקות התרבות 3D לאפשר לדור של organoids דמויי רקמה מתאי גזע מושרים (iPSCs). במבחנת הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבות השעית 3D מאפשר ההיווצרות של סוגי תאים שונים במועד ובאזור ספציפי, והוליד רקמות מאורגנות, מרובדת ^{1, 2, 3.} הודות מעבד כי חלוץ בטכנולוגיות תרבות 3D ו demystified המורכבת של היווצרות איברים, החלה מתאי גזע,פתחנו שיטה חזקה של יצירת organoids המוח להתוות אירועים מוקדמים של התפתחות מוח אנושית מודל ממיקרוצפלוס- במבחנה ^{1, 2, 3.} ראוי לציין כי התאמנו בשיטה המקורית שפיתח לנקסטר ואח. ¹ כדי ליצור organoids מוחין. שיטה זו שונתה על פי דרישות הניסוי שלנו.

מטרת מחקר מ ואח 'גבריאל. היה לנתח את המנגנונים התאיים ומולקולריים של תחזוקת תאי גזע עצבית במהלך התפתחות המוח. על מנת לעשות זאת, מחקר המכניסטי בוצע באמצעות ניתוח ובתאים עצביים (NPCs) ב organoids מוח 3D נגזר חולה ממיקרוצפלוס- ^4. החולה הזה נשא מוטציה CPAP, חלבון centrosomal נשמר הנדרשים biogenesis centrosome ^5. היפו מקובלהתזה היא כי ממיקרוצפלוס- הוא התוצאה של דלדול של ברכת NPC, זה עלול לנבוע גם למוות של תאים או בידול מוקדם ^{1, 6, 7, 8, 9.}

על ידי ניתוח אזורי חדרית (VZs) של organoids המוח ממיקרוצפלוס-, הודגם כי מספר משמעותי של NPCs לעבור חלוקת התא סימטרית, בניגוד organoids המוח נגזר מתורם בריא ^4. ניתוחים מיקרוסקופים וביוכימיים נרחבים של organoids מוח microcephalic חשפו תפקיד לא צפוי עבור CPAP מבולגן ריסים בזמן ^4. באופן ספציפי, CPAP מוטציה מזוהה עם פירוק cilium מפגר מחדש כניסת מחזור התא מתעכבת, מה שמוביל את הבידול המוקדם של NPCs ^4. תוצאות אלו מצביעות על תפקיד עבור ריסים ב ממיקרוצפלוס- ו המעורבות EIR במהלך מלא הנוירוגנזה גודל המוח ^10.

חלקו הראשון של פרוטוקול זה הוא תיאור של שיטת שלושת השלבים ליצירת organoids המוח הומוגנית. כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול לנקסטר המקורי הותאם ו שונה שמתאים למטרות שלנו ^1. ראשית, iPSCs אדם מתורבת מצב מזין ללא מוגדר על Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) מטריקס. צעד זה ימנע את הווריאציות של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מזין תלוי. בפרוטוקול זה, בדומה להשפעת בידול העצבי להקים אפיתל עצבית מתחילה ישירות iPSCs. אם תדלג גוף embryoid (EB) צעד ההיווצרות, את ההתמיינות העצבית בצורה מבוקרת יותר וביים. גישה זו מגבילה את ההיווצרות הספונטנית undirected של שכבות תאי ניבט אחרות, כגון המזודרם ו endoderm. על ידי יישום פרוטוקול זה, neurospheres המכיל רוזטות עצבית ניתן לקצור ביום 5 עבור EHS הטבעת מטריקס ותרבות השעיה נייחת. מדיום organoid המשמש את הצעד השלישי של הפרוטוקול שלנו הוא השלים עם dorsomorphin ו SB431542. Dorsomorphin הוא מעכב מולקולות קטנות של חלבון העצם morphogenic (BMP), וכן SB431542 מעכב את TGFβ / Activin / מסלול איתות קטרים. השילוב של גורמים אלה יכול לקדם בידול עצבי בצורה יעילה יותר מאשר חומצה רטינואית לבד ^{11, 12, 13, 14.}

בסך הכל, שינויים אלה מאפשרים לדור לשחזור של organoids המוח, עם וריאציות מינימאליות ברחבי organoids. חשוב לציין, שיטה זו יושמה כדי ליצור organoids המוח microcephalic וחסונה מן iPSCs החולה, הנושאות מוטציות בגנים המשפיעים centrosomes והדינמיקה מחזור התא.

החלק השני של פרוטוקול זה נותן הוראות להכנת brAin organoids לניתוח ופרשנות של ליקויים הסלולר ממיקרוצפלוס-. זה כולל קיבוע, cryosectioning, מכתים immunofluorescent, ואת ניתוח מיקרוסקופי confocal. פרוטוקול זה יספק את הקורא עם תיאור מפורט של תוצאות צפויות ובליווי לפרשנות.