Humane nevrologiske lidelser, for eksempel microcephaly, kan bare lite studert i dyremodeller på grunn av det faktum at menneskelige hjerne har en utvidet kortikale overflate, en unik funksjon som er forskjellig fra ikke-humane dyr.

Dette aspektet gjør menneskelige hjerne utvikling en kompleks prosess som ikke i tilstrekkelig grad kan studeres i en 2D, in vitro cellekultursystem. Vekst 3D-kulturteknikker muliggjør genereringen av vev-lignende organoids fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Den in vitro differensiering av pluripotente stamceller i et 3D-suspensjonskultur muliggjør dannelsen av forskjellige celletyper på en riktig og område-spesifikk måte, noe som gir opphav til en organisert, lagdelt vev ^{1, 2, 3.} Takket være laboratorier som var foregangs 3D kulturteknologi og demystified kompleksiteten av organdannelse, ved å starte fra stamcellervi utviklet en robust metode for å generere hjerne organoids å avgrense tidlige hendelser av human utvikling av hjernen og å modellere microcephaly in ^{vitro-1, 2, 3.} Det er bemerkelsesverdig at vi tilpasset den opprinnelige metoden utviklet av Lancaster et al. å generere cerebrale organoids ^1. Denne metoden ble endret i henhold til våre eksperimentelle krav.

Hensikten med en studie fra Gabriel et al. var å analysere de cellulære og molekylære mekanismer for neurale stamcelle vedlikehold i løpet av utvikling av hjernen. For å gjøre dette, ble en mekanistisk studie utført ved analyse av neurale progenitorceller (NPC) i 3D hjerne organoids avledet fra en pasient microcephaly ^4. Denne pasienten båret en mutasjon i CPAP, en konservert centrosomal protein som er nødvendig for sentrosomen biogenese ^5. En allment akseptert hypoOppgaven er at microcephaly er et resultat av en utarming av NPC bassenget, og dette kan skyldes enten til celledød, eller til for tidlig differensierings ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Ved å analysere de ventrikulære sonene (VZs) av microcephaly hjerne organoids, ble det vist at et betydelig antall av NPC gjennomgå asymmetrisk celledeling, i motsetning til hjernen organoids som stammer fra en frisk donor ^4. Omfattende mikroskopiske og biokjemiske analyser av microcephalic hjerne organoids viste en uventet rolle for CPAP i tide cilia demontering ^4. Nærmere bestemt er mutert CPAP forbundet med retardert cilium demontering og forsinket cellesyklus reentring, som fører til for tidlig differensiering av ^NPC-4. Disse resultatene tyder på en rolle for flimmerhårene i microcephaly og thEIR engasjement under nevrogenesen og hjernestørrelse kontroll ^10.

Den første delen av denne protokollen er en beskrivelse av en tre-trinns metode for å frembringe homogene hjerne organoids. Som nevnt før, ble den opprinnelige Lancaster protokollen tilpasset og modifisert for å passe vårt formål ^1. For det første humane iPSCs dyrkes i et definert mater-fri tilstand på Engelbreth-Holm-sverm (HMS) matrise. Dette trinnet unngår variasjoner av mater-avhengige pluripotent stamcelle-kulturer. I denne protokollen, til induksjon av nevrale differensiering danner neurale epitel starter direkte fra iPSCs. Ved å hoppe over den embryoid legeme (EB) dannelsestrinn, neural differensiering foregår i en mer kontrollert og dirigert måte. Denne fremgangsmåten begrenser den spontane og urettet dannelse av andre kimcelle-lag, så som mesoderm og endoderm. Ved å bruke denne protokollen, kan neurosfærer som inneholder neurale rosetter bli høstet på dag 5 etter EHS matrise innebygging og stasjonær suspensjonskultur. Den organoid medium som anvendes for det tredje trinn i vår protokoll er supplert med dorsomorphin og SB431542. Dorsomorphin er en småmolekyl-inhibitor av benmorfogent protein (BMP), og SB431542 hemmer TGFp / aktivin / nodal signalveien. Kombinasjonen av disse faktorene kan fremme nerve differensiering mer effektivt enn retinsyre alene ^{11, 12, 13, 14.}

Til sammen er disse modifikasjoner muliggjøre reproduserbare generering av hjerne organoids, med minimale variasjoner på tvers av organoids. Viktigere, ble denne metoden anvendt for å generere robuste microcephalic hjerne organoids fra pasient iPSCs, som bærer mutasjoner i gener som påvirker centrosomer og celle-syklus dynamikk.

Den andre delen av denne protokollen gir instruksjoner om å forberede brain organoids for analyse og tolkning av cellulære defekter i microcephaly. Dette inkluderer fiksering, cryosectioning, immuno-fluorescensfarging, og konfokal mikroskopisk analyse. Denne protokollen vil gi leseren en detaljert beskrivelse av forventede resultater, og med veiledning for tolkning.