Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode

La visualisation des neurones individuels dans des échantillons de tissus permet de l'analyse in situ des caractéristiques morphologiques des neurones, ce qui a considérablement fait progresser notre compréhension du cerveau et comment elle peut être influencée par la maladie endogène ou des facteurs environnementaux exogènes. La méthode de coloration Golgi-Cox est un rapport coût-efficacité, des moyens relativement simples de coloration d'un échantillon aléatoire de neurones dans le cerveau. D' abord développé par Golgi ¹ et modifié par Cox ² dans les années 1800, les chercheurs ont affiné cette technique au cours des années à produire des neurones clairs, bien colorés qui peuvent être utilisés pour visualiser et de quantifier à la fois la morphologie des arbres dendritique et la densité de la colonne vertébrale ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Une considération importante technique pour la visualisation des neurones colorés dans les sections du cerveau est l'épaisseur de la tranche maximale, qui est limitée par la distance de travail des objectifs disponibles de microscope à fort grossissement / haute résolution. Objectifs communs d'immersion d'huile dans les années 60 – 100X gamme offrent une excellente résolution, mais sont limités par leurs distances de travail qui ne sont généralement pas supérieure à 200 um. Les coupes de cerveau coupées à 200 um gamme peuvent être adéquates pour visualiser certains types de neurones qui peuvent être contenus à l'intérieur de cette épaisseur de tranche, par exemple des neurones pyramidaux dans les couches superficielles du cortex cérébral ^{10, 11, 12,} les neurones pyramidaux de la région CA1 de la hippocampe ^{13, 14,} et les cellules granulaires du gyrus denté de l'hippocampe ^15. Neurones avec relativement plusarbres dendritiques, tels que les neurones pyramidaux dans les couches profondes du cortex cérébral que pour la souris peut dépasser de plus de 800 um à partir du corps de la cellule ^16, fournissent un plus grand défi , car les cerveaux devraient être sectionné à un angle idéal pour contenir l'ensemble de l' arbre dendritique à moins de 200 um tranches. Cela peut ne pas être encore possible si un dendrites ou l'une de ses branches s'étendent dans la direction rostrale ou caudale. Bien qu'il soit possible de remédier à cette limitation en traçant un neurone à travers plusieurs sections du cerveau adjacentes, cette approche présente un défi technique important dans l' alignement des sections avec précision pour le traçage ^17. Une approche plus pratique serait de visualiser les neurones entiers contenus dans les sections du cerveau qui sont découpées à une plus grande épaisseur.

Nous rapportons ici une technique pour colorer les neurones dans 400 – coupes de cerveau d'épaisseur 500 um de souris en utilisant la méthode Golgi-Cox, et de visualiser leur morphology en utilisant un objectif à immersion dans l'huile silicone à haute résolution qui a une distance de travail de 800 um. Le protocole d'imprégnation et de traitement Golgi-Cox que nous décrivons est modifié à partir de l' un des protocoles modernes les plus cités dans la littérature ^6. Notre approche avec des coupes de cerveau épais offre l'avantage d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones de tout type qui sont entièrement contenu dans la section. En plus du protocole principal, nous présentons également deux variantes qui offrent des avantages uniques: (1) coloration Golgi-Cox avec le contre-colorant violet de crésyl sur la surface des sections montées, afin de définir les limites des régions du cerveau et d'identifier les couches de la cortex cérébral, et (2) la coloration de Golgi-Cox avec une étape intermédiaire de congélation pour le stockage à long terme des cerveaux entiers imprégnés avant la coupe et le traitement final.