Нейроны обработки изображений внутри толстых срезов мозга с помощью метода Гольджи-Кокса

Визуализация отдельных нейронов в образцах тканей позволяет на месте анализа нейронных морфологических характеристик, которые значительно продвинули наше понимание мозга и как это может быть под влиянием эндогенных заболеваний или экзогенных факторов окружающей среды. Метод окрашивания Гольджи-Кокса является экономически эффективными, относительно простых способами окрашивания случайной выборки нейронов в головном мозге. Во- первых , разработанный Гольджи ¹ и модифицированной Коксом ² в 1800 – х годах, исследователи доработан эту технику на протяжении многих лет , чтобы произвести четкие, хорошо окрашенные нейроны , которые могут быть использованы для визуализации и количественного определения как дендритной морфологии дерева и плотность позвоночника ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9},

Основным техническим фактором для визуализации нейронов, окрашенных в срезах мозга максимальная толщина среза, которая ограничена рабочим расстоянием, имеющихся в наличии высокого увеличения / микрообъективов с высокой разрешающей способностью. Общие цели масло погружения в 60 – 100X диапазон обеспечивают превосходное разрешение, но ограничены их рабочими расстояниями, которые не являются, как правило, не более 200 мкм. Срезы мозга разрезать на мкм диапазона 200 могут быть достаточными , чтобы визуализировать определенные типы нейронов , которые могут содержаться в пределах этой толщины среза, например пирамидальных нейроны в неглубоких слоях коры головного мозга ^{10, 11, 12,} пирамидальных нейронов в области СА1 из гиппокампа ^{13, 14} и зернистых клеток в зубчатой извилине гиппокампа ^15. Нейроны с относительно болеедендритные дерева, такие как пирамидальные нейроны в пределах глубоких слоев коры головного мозга , что для мыши может продлить более 800 мкм от тела ¹⁶ клеток, обеспечивает большую проблему , потому что мозг должен были бы быть разрезали на идеальный угле , чтобы содержать все дендриты дерева в пределах 200 мкм ломтиков. Это может даже не быть возможным, если дендрит или любой из его ветвей проходят в ростральной или каудальном направлении. В то время как можно решить это ограничение путем отслеживания нейрона на нескольких соседних участках мозга, этот подход представляет существенную техническую проблему в точном выравнивании разделов для отслеживания ^17. Более практичным подходом было бы визуализировать целые нейроны, содержащиеся в срезах головного мозга, которые разрезаются на большей толщины.

Мы сообщаем здесь технику, чтобы окрасить нейроны в пределах 400 – 500 мкм срезах мозга мышей с помощью метода Гольджи-Кокса, и визуализировать их моrphology использование кремния цели масла погружения с высоким разрешением, который имеет рабочее расстояние 800 мкм. Пропитки и обработки протокола Гольджи-Кокса , который мы описываем модифицирован из одной из самых цитируемых современных протоколов в литературе ^6. Наш подход с толстыми срезами мозга обеспечивает преимущество увеличения вероятности идентификации нейронов любого типа, которые полностью входит в секции. В дополнении к основному протоколу, мы также присутствует два варианта, которые обеспечивают уникальные преимущества: (1) Гольджи-Кокса окрашивание с крезили фиолетовые контрастирующие на поверхности смонтированных участков, с тем чтобы определить границы областей головного мозга и определить слои кора головного мозга, и (2) Гольджи-Кокса окрашивание с промежуточной стадии замораживания для длительного хранения пропитанных весь мозг перед секционирования и окончательная обработка.