ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

組織サンプル内の個々の神経細胞の可視化は、脳の我々の理解を進めて大きくしており、それは、内因性疾患または外因性の環境要因によって影響を受ける可能性がどのようにニューロンの形態学的特性のその場での分析を可能にします。ゴルジ – コックスの染色方法は、脳内の神経細胞のランダムなサンプルを染色の費用対効果の高い、比較的簡単な手段です。第ゴルジ¹によって開発され、1800年代コックス²によって修飾、研究者らはさらに^、樹状ツリー形態および棘密度^3,4の両方を可視化し、定量化するために使用することができる透明な、十分に染色されたニューロンを産生するために長年にわたってこの技術を洗練しています^{5、6、7、8、9}。

脳切片中の染色されたニューロンの可視化のための主要な技術的な考慮事項は、使用可能な高倍率/高解像度の顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される最大スライス厚、です。 60で共通の油浸対物レンズ – 100Xは、優れた分解能を提供する範囲であるが、一般的には200μmよりも大きくない彼らの作動距離によって制限されています。 200μmの範囲で切断脳切片は、大脳皮質¹⁰の浅い層で例示錐体ニューロン^{、11、12、}のCA1領域における錐体ニューロンのために、このスライスの厚さ内に収容することができる特定のニューロンタイプを視覚化するのに十分であってもよいです海馬^13、14、及び海馬¹⁵の歯状回における顆粒細胞。比較的長いとニューロンこうした脳は全体の樹状突起の木を含むように完璧な角度で切断する必要があるため、セル本体¹⁶から800以上ミクロンを拡張することができ、マウスのために、より大きな挑戦を提供大脳皮質の深い層内の錐体細胞として樹状突起、 200枚のμmの切片内。デンドライトまたはその枝のいずれかが吻側または尾側方向に延びている場合、これはさえ実現可能ではないかもしれません。それは複数の隣接する脳切片を横切ってニューロンを追跡することによってこの制限に対処することは可能であるが、このアプローチは^17をトレースするための正確セクションを整列させるに重要な技術的課題を紹介します。より実用的なアプローチは、より大きな厚さで切断された脳切片内に含まれる全体のニューロンを可視化することであろう。

ゴルジ – コックス法を用いたマウスの500ミクロン厚の脳切片、および彼らのMOを視覚化するために – 私たちはここに400内のニューロンを染色する技術を報告しますrphology800μmの作動距離を有する高分解能シリコン油浸対物レンズを使用。我々は説明ゴルジコックス含浸処理プロトコルは文献⁶に最も引用現代プロトコルのいずれかから変更されています。厚い脳切片との我々のアプローチは、完全にセクション内に含まれる任意のタイプのニューロンを同定する確率を増加させるという利点を提供します。ユニークな利点を提供するメインプロトコル、我々もまた、本2つのバリエーションに加えて：取り付けられた部分の表面にクレシルバイオレット対比（1）ゴルジコックス染色、脳領域の境界を画定するための層を識別するために切片および最終処理の前に含浸全脳の長期保存のための中間凍結ステップと大脳皮質、及び（2）ゴルジコックス染色。