Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

A visualização dos neurónios individuais dentro de amostras de tecido permite a análise in si tu de características morfológicas de neurónios, que tem avançado de forma significativa a nossa compreensão do cérebro e como ela pode ser influenciada pela doença endógeno ou factores ambientais exógenos. O método de coloração de Golgi-Cox é um meio eficaz em termos de custos, relativamente simples de marcação de uma amostra aleatória de neurónios no cérebro. Primeiro desenvolvido por Golgi ¹ e modificado por Cox ² em 1800, os investigadores têm refinado ainda mais esta técnica ao longo dos anos para produzir neurónios claras, bem corados que podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto morfologia árvore dendrítica e densidade da coluna ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Uma consideração importante técnica para a visualização dos neurónios corados nas secções do cérebro é a espessura máxima fatia, que é limitada pela distância de trabalho de objectivos disponíveis de elevada ampliação / de alta resolução de microscópio. objetivos de imersão em óleo comuns no 60 – 100X intervalo fornece excelente resolução, mas são limitados por suas distâncias de trabalho que são tipicamente não superior a 200 mm. Secções cerebrais cortados no pm gama 200 pode ser adequado para visualizar certos tipos neuronais que podem estar contidos dentro desta espessura da fatia, por exemplo, neurónios piramidais em camadas superficiais do córtex cerebral ^{de 10, 11, 12,} neurónios piramidais na região CA1 do hipocampo ^{13, 14,} e as células granulares no giro dentado do hipocampo ^15. Neurônios com relativamente mais longoárvores dendriticas, tais como os neurónios piramidais em camadas profundas do córtex cerebral que para o rato pode estender-se mais do que 800 um a partir do corpo da célula ^16, proporcionam uma maior desafio porque os cérebros teriam de ser seccionados com um ângulo ideal para conter toda a árvore de dendrite dentro de 200? m fatias. Isso pode até não ser viável se um dendrite ou qualquer de seus ramos se estendem na direção rostral ou caudal. Embora seja possível para resolver esta limitação, traçando um neurônio em várias seções cerebrais adjacentes, esta abordagem apresenta um desafio técnico significativo em alinhar as secções com precisão para rastrear ^17. Uma abordagem mais prática seria para visualizar os neurónios inteiras contidos dentro de secções do cérebro que são cortadas a uma espessura maior.

Relatamos aqui uma técnica para corar neurónios dentro 400-500 seces cerebrais de espessura de ratinhos, utilizando o método de Golgi-Cox, e para visualizar a sua morphology usando uma objectiva de silício de imersão em óleo de alta resolução que tem uma distância de trabalho de 800? m. A impregnação e o processamento do protocolo de Golgi-Cox que descrevemos é modificado a partir de um dos protocolos mais modernos-citados na literatura ^6. A nossa abordagem com secções de cérebro de espessura proporciona a vantagem de aumentar a probabilidade de identificação de neurónios de qualquer tipo dos que são totalmente contida dentro da secção. Em adição ao protocolo principal, que também apresentam duas variações que fornecem vantagens únicas: (1) a coloração de Golgi-Cox com o contra-corante violeta de cresilo na superfície de secções montadas, de modo a definir os limites de regiões do cérebro e para identificar camadas da córtex cerebral, e (2) a coloração de Golgi-Cox com um passo de congelação intermédia para o armazenamento de longo prazo de impregnados cérebros inteiros antes do corte e o processamento final.