الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس
Summary
نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.
Abstract
وقد استخدمت طريقة جولجي كوكس من تلطيخ الخلايا العصبية لأكثر من مائتي عام لتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل الدماغ العينات النسيجية. في حين أنه من الأفضل من الناحية العملية لإعداد أقسام الدماغ في أكبر سمك ممكن، من أجل زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية الملون التي ترد بشكل كامل داخل الأقسام واحدة، وهذا النهج هو محدود من منظور تقني من العمل لمسافات عالية ، تكبير أهداف المجهر. ونحن هنا التقرير بروتوكول لصبغ الخلايا العصبية باستخدام طريقة جولجي كوكس في أقسام مخ الفأر أن يتم قطع في 500 سمك ميكرون، وتصور الخلايا العصبية في جميع أنحاء عمق هذه المقاطع باستخدام المجهر تستقيم مزودة عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. نحن أيضا الإبلاغ عن الخيارين مفيدة من هذا البروتوكول التي يمكن استخدامها لمباين سطحشنت أقسام الدماغ مع نيسل وصمة عار الكريزيل البنفسجي، أو لتجميد العقول كلها للتخزين طويل الأجل قبل باجتزاء والتجهيز النهائي. بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين تنتج أقسام الدماغ سميكة الملون، في جميع أنحاء الذي الكاملة أشجار الخلايا العصبية شجيري والعمود الفقري تغصناته يمكن تصور موثوق وكميا.
Introduction
التصور من الخلايا العصبية الفردية داخل عينات الأنسجة يسمح للفي الموقع تحليل الخصائص المورفولوجية الخلايا العصبية، التي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للدماغ وكيف يمكن أن يتأثر بها المرض الذاتية أو العوامل البيئية الخارجية. طريقة تلوين جولجي كوكس هو، وسيلة فعالة من حيث التكلفة بسيطة نسبيا من تلطيخ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الدماغ. أول من وضعه جولجي 1 وتعديلها من قبل كوكس 2 في 1800s، ومزيد من الصقل الباحثون هذه التقنية على مر السنين لإنتاج واضحة، والخلايا العصبية الملون بشكل جيد والتي يمكن استخدامها لتصور وتحديد كلا مورفولوجيا الشجرة شجيري وكثافة العمود الفقري 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9.
وهناك اعتبار تقني رئيسي لتصور الخلايا العصبية الملون داخل أقسام الدماغ هو الحد الأقصى للسمك شريحة، والذي يحد من مسافة العمل من الأهداف المتاحة عالية التكبير / عالية الدقة المجهر. الأهداف النفط الغمر المشتركة في 60 – 100X مجموعة توفر قرار ممتاز، ولكن تقتصر مسافات عملهم التي عادة ما لا يزيد عن 200 ميكرون. أقسام الدماغ قطع في ميكرون مجموعة 200 قد تكون كافية لتصور أنواع الخلايا العصبية معينة التي يمكن الواردة في هذا شريحة سمك، على سبيل المثال العصبونات الهرمية في طبقات عميقة من القشرة المخية 10، 11، 12، الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين 13 و 14، والخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن من الحصين (15). الخلايا العصبية مع أطول نسبياأشجار الجذعية، مثل الخلايا العصبية الهرمية داخل الطبقات العميقة من القشرة الدماغية التي فأرة الحاسوب يمكن أن تمتد أكثر من 800 ميكرون من خلايا الجسم 16، وتوفير تحديا أكبر لأنه لن تحتاج إلى مقطوع في زاوية مثالية العقول لاحتواء شجرة تغصناته كامل في حدود 200 ميكرون شرائح. قد لا يكون هذا ممكنا إذا كان التغصنات أو أي من فروعها تمتد في اتجاه منقاري أو الذيلية. في حين أنه من الممكن معالجة هذا القيد عن طريق تتبع الخلايا العصبية عبر عدة أقسام الدماغ المجاورة، ويدخل هذا النهج تحديا تقنيا كبيرا في التوفيق بين الأقسام بدقة للبحث عن المفقودين (17). ومن شأن اتباع نهج أكثر واقعية يكون لتصور الخلايا العصبية كلها الواردة في أقسام الدماغ التي قطعت في سمك أكبر.
نفيدكم هنا تقنية وصمة عار الخلايا العصبية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران باستخدام طريقة جولجي كوكس، وتصور لهم موrphology باستخدام عالية الدقة السيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. يتم تعديل التشريب وتجهيز بروتوكول جولجي كوكس التي وصفنا من أحد البروتوكولات الحديثة الأكثر ذكرا في الأدب 6. نهجنا مع أقسام الدماغ سميكة يوفر ميزة زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية من أي نوع أن ترد بشكل كامل داخل القسم. وبالإضافة إلى البروتوكول الرئيسي، ونحن أيضا موجودة شكلان التي توفر مزايا فريدة من نوعها: (1) جولجي كوكس تلطيخ مع مباين الكريزيل البنفسجي على سطح أقسام المركبة، من أجل تحديد حدود مناطق الدماغ وتحديد طبقات قشرة الدماغ، و (2) جولجي كوكس تلطيخ مع خطوة تجميد المتوسطة للتخزين على المدى الطويل من العقول كلها مشربة قبل باجتزاء والتجهيز النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول تلطيخ جولجي كوكس جنبا إلى جنب مع اثنين من المتغيرات مفيدة لتصور الخلايا العصبية داخل أقسام الدماغ سميكة. كما هو مبين في ممثل النتائج، واستخدام هدفا عالية الدقة لديه طويلة المسافة 800 ميكرون العمل يسمح التصور يمكن الاعتماد عليها من الخلايا العصبية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة ديسكفري إلى CDCB من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وجون ريس ايفانز صندوق قادة منحة البنية التحتية البحثية لCDCB من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI مشروع رقم 30381)، و منحة ديسكفري إلى NJM من NSERC. وأيد ELL عن طريق منح الدراسية أونتاريو العليا وعن طريق منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف. وأيد CDS عن طريق مساعدة مالية البحوث الجامعية الطالب من NSERC. وأيد ALM عن طريق منح الكسندر غراهام بيل من NSERC وقبل منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. . From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
