Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in – situ – Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi ¹ entwickelt und modifiziert von Cox ² in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte ^{3, 4,} zu quantifizieren ^{5, 6, 7, 8, 9}.

Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 – 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 & mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde ^{10, 11, 12,} pyramidalen Neuronen in der CA1 – Region des Hippocampus ^{13, 14} und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus ^15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper ^16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 & mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung ¹⁷ zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden.

Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 & mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur ⁶ modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.