תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי
Summary
התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.
Abstract
תוכנית התחדשות אנדוגני הוא שיזם גליה מולר של דג הזברה מבוגר (Danio rerio) הרשתית בעקבות נזקים עצביים ומוות. גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר ובתאים עצביים העוברים סיבובים הבאים של חלוקות תא להתמיין לסוגי התאים העצביים האבודים. שתי גליה מולר ו תא אב עצבי גרעינים לשכפל DNA שלהם ועוברים מיטוזה ב מיקומים שונים של הרשתית, כלומר הם נודדים בין השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) ואת השכבה החיצונית הגרעינית (ONL), בהתאמה, בתהליך המתואר Interkinetic הגירה גרעינית (INM). INM נחקרה בעיקר ברשתית מתפתחת. כדי לבחון את הדינמיקה של INM ב מבוגר התחדשות רשתית דג זברה בפירוט, הדמית תא החי של גליה fluorescently שכותרתו מולר / ובתאים עצביים נדרשה. כאן, אנו מספקים את התנאים לבודדי רשתיות הגבו תרבותמ Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 שנחשפו אור חזק מתמיד במשך 35 שעות. כמו כן, אנו מראים כי בתרבויות רשתית אלה הם קיימא לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאים, רכישה ברציפות Z- מחסנית תמונות ברחבי העובי של explant הרשתית עד 8 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton לפקח על התנהגות הנדידה של GFAP: nGFP תאי -positive . בנוסף, אנו מתארים את הפרטים לבצע ניתוח הדמיה פוסט כדי לקבוע את המהירות של INM apical ואת הבסיס. לסיכום, הקמנו תנאים כדי ללמוד את הדינמיקה של INM במודל בוגרת ההתחדשות הנוירונים. זה יקדם את הבנתנו בתהליך הסלולר המכריע הזה ולאפשר לנו לקבוע את המנגנונים השולטים INM.
Introduction
בניגוד לבני האדם, דג זברה (Danio rerio) תערוכת תגובת התחדשות חזקה על מוות של תאים של נוירונים ברשתית 1, 2, 3, 4. Α גורם גידול הנימק, מולקולת איתות כי הוא שוחרר מהמוות נוירונים ברשתית גורמת גליה מולר המתגוררת השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) של הרשתית, להתרבות 5 ולייצר ובתאים עצבים ממשיכים להתרבות לפני ההבחנה לתוך התאים העצביים סוגים כי מת 2, 3, 4. בשלב השגשוג של תגובת ההתחדשות, הגרעינים של גליה מולר ו ובתאים העצביים הנגזרות מהם לעבור דפוס נודד חוזר בשלב עם מחזור התא (ההגירה הגרעינית Interkinetic, INM) 6 </sup >, 7. גרעינים מיקומו של INL הבזליים לשכפל DNA שלהם לפני המעבר לשכבה החיצונית גרעיני (ONL) שבו הם מחלקים לפני הגרעינים הנובעים לחזור basally אל INL. תהליך זה תואר לראשונה במהלך התפתחות neuroepithelial בשיטות היסטולוגית, תוך גישות הדמית תא חי מאוחר יותר אשרו את הפרשנות על ידי סואר 8, 9, 10, 11, 12. שתי הגישות הדמיה histochemical ולחיות תאים שימשו כדי לקבוע המנגנונים INM ותפקודו בפיתוח neuroepithelia כולל הרשתית 9, 11, 12, 13. עם זאת, המנגנונים השולטים INM ב המבוגר התחדשות הרשתית לא נחקרו בפירוט רבXref "> 6, 7. הדמיה של תא חי תהיה גישה לא יסולא בפז כדי לקדם את הידע שלנו של מסלולי איתות השולטים INM ברשתית התחדשות מבוגר.
עד לאחרונה, הדמית תא החי של INM ברשתית הוגבלה או עוברי דג זברה לחיות או חומוס עוברי או עכבר לאחר לידת explants רשתית 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. בעוד explants רשתית מחיות בוגרת מגוון של מינים, כוללים עכבר, חולדת דג זברה כבר נוצל עבור תאים שונים גישות ביולוגיות 17, 18, 19, 20, ניסויי הדמיה לחיות תאים באמצעות חה explants הרשתיתve הוגבלה לתדרך את פרקי הזמן בהם ולא הוצאו להורג באופן רציף ולאורך כמה שעות 21, 22. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי רשתית דג זברה מבוגרת אור פגוע התרבות לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאי INM ניטור באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון 6. גישות הדמיה תאים חיים הם יתרון על פני שיטות immunohistochemical כאשר חוקרים את מנגנוני השליטה INM, הדינמיקה של INM, למשל, מהירויות עלול להיפגע במקום המיקום של מיטוזה, אשר באופן פוטנציאלי לא יהיה מזוהה באמצעות immunocytochemistry.
בעתיד, בשיטה זו יש גם פוטנציאל להיות שונה כדי לחקור תהליכים דינמיים אחרים במהלך רגנרציה רשתית, כגון phagocytosis למות קולטני האור על ידי גליה מולר או התנהגות של שריר כלשהו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים חוקרים את המנגנונים השולטים התחדשות של המבוגר הפגום רשתית דג זברה בעיקר שיטות immunocytochemical משומשות 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. קביעת תנאים כדי expla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את התמיכה שמספקת ויליאם ארצ'ר ואת מתקן ההדמיה המשולבת נוטרדאם. תודה מיוחדת מופנים הטכנאים מדעי החיים פריימן לעזרה רציפה שלהם וטיפול בבעלי שלהם של דג הזברה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין של NIH כדי DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) והמרכז דג הזברה מחקר, אוניברסיטת נוטרה דאם, נוטרה דאם, IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
