多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化
Summary
ゼブラフィッシュ網膜再生は、主に固定した網膜を用いて研究されています。しかしながら、このようなinterkinetic核移行などの動的プロセスは、再生反応時に発生し、根底にあるメカニズムを調べるために生細胞イメージングを必要とします。ここでは、多光子顕微鏡を用いてリアルタイムにInterkinetic原子力移行（INM）を監視するために文化や撮影条件を説明します。
Abstract
内因性の再生プログラムは、神経損傷と死を、次の網膜大人のゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ ）にミュラーグリアによって開始されます。ミュラーグリア細胞周期を再入力して、細胞分裂のその後のラウンドを受け、失われた神経細胞型に分化神経前駆細胞を産生します。両方のミュラーグリアと神経前駆細胞核は、それらのDNAを複製し、Interkineticとして記載された方法で、網膜、 すなわち、それらは、それぞれ、基礎内顆粒層（INL）及び（ONL）外顆粒層との間の移行の別個の位置で有糸分裂を受けます核移行（INM）。 INMは、主に発展途上の網膜に研究されてきました。詳細にゼブラフィッシュ網膜の再生成人にINMのダイナミクスを調べるために、蛍光標識されたミュラーグリア/神経前駆細胞の生細胞イメージングが必要です。ここでは、単離するための条件や文化の背側網膜を提供しますTgはから[GFAP：nGFP] 35時間一定の強い光にさらされたmi2004のゼブラフィッシュ。我々はまた、これらの網膜培養物を連続的にGFAPの遊走挙動を監視するために多光子顕微鏡を用いて、最大8時間の網膜外植片の厚さ全体にわたってzスタック画像を取得し、生細胞イメージング実験を行うために実行可能であることを示している。nGFP陽性細胞。また、我々は、頂端および基底INMの速度を決定するために、ポスト画像解析を実行するための詳細を説明します。要約すると、我々は、神経再生の成人モデルにINMのダイナミクスを研究するための条件を確立しました。これは、この重要な細胞プロセスの我々の理解を進め、私たちはINMを制御するメカニズムを決定することができます。
Introduction
ヒトとは異なり、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、網膜神経細胞1、2、3、4の細胞死の際に強固な再生応答を示します。腫瘍壊死因子α、網膜神経細胞が死ぬから放出されるシグナル伝達分子が網膜の基底内顆粒層（INL）に存在するミュラーグリア細胞を誘導し、5を増殖し、神経細胞に分化する前に増殖し続ける神経前駆細胞を産生します2死亡したタイプ、3、4。再生応答の増殖期の間に、ミュラーグリアの核とその派生神経前駆細胞は、細胞周期（Interkinetic原子力移行、INM）6と同位相の繰り返しの移動パターンを受けます</sup >、7。基礎INL内に配置核が生じる核がINLに基底に戻る前に、彼らは分裂外顆粒層（ONL）に移行する前にそれらのDNAを複製します。生細胞イメージング手法後ザウアー8、9、10、11、12により解釈を確認しながら、このプロセスは、最初に、組織学的方法を用いて、神経上皮開発中に記載されました。両方の組織化学的および生細胞イメージングアプローチはINMと網膜9、11、12、13を含むneuroepithelia開発におけるその機能の根底にあるメカニズムを決定するために使用されています。しかし、網膜を再生する大人にINMを支配するメカニズムはあまり詳細に研究されていません外部参照"> 6、7。ライブセルイメージングは、網膜を再生する大人にINMを制御するシグナル伝達経路の知識を進めるために貴重なアプローチとなります。
最近まで、網膜のINMの生細胞イメージングライブゼブラフィッシュ胚のいずれかに、またはニワトリ胚または出生後のマウスの網膜外植片9、10、11、12、14、15、16に限定されていました。マウス、ラット、およびゼブラフィッシュを含む様々な種の成体動物からの網膜外植片は、異なる細胞生物学的手法17、18、19、20、網膜外植片を、HAを用いて、生細胞イメージング実験のために利用されてきたがVEのは時間の期間を短時間に制限され、数時間21、22にわたって連続的に実行されていません。ここでは、多光子顕微鏡6を用いて、生細胞イメージング実験の監視INMを実行するために培養光損傷を受けた大人のゼブラフィッシュ網膜に詳細なプロトコルを記述します。 INMのダイナミクスとして、 例えば、速度はむしろ、潜在的に免疫細胞化学を用いて検出されない有糸分裂の場所、より影響を受ける可能性がある、INMを制御するメカニズムを調査する際ライブセルイメージングアプローチは免疫組織化学的方法よりも有利です。
将来的には、この方法はまた、ミュラーグリアまたはミクログリアの行動によって、このような瀕死の光受容体の食作用などの網膜再生中に他の動的プロセスを研究するように変更される可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
損傷した成体ゼブラフィッシュ網膜主に使用される免疫細胞化学的方法5、25、26、27、28、29、30の再生を支配するメカニズムを調べる研究。文化網膜外植片に条件を確立し、そのようなINM等の現象、上のライブセルイメ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ウィリアム・アーチャーとノートルダム統合イメージング施設によって提供されるサポートに感謝しています。特別な感謝は彼らの継続的な支援とそのケアやゼブラフィッシュの飼育のためにフライマンライフサイエンス技術者を対象としています。この研究は、DRHにNIHの国立眼研究所（R01-EY018417、R01-EY024519）とゼブラフィッシュ研究センター、ノートルダム大学、ノートルダム、INからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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