Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens ^{1, 2, 3, 4.} Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l'basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer ⁵ et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les types qui sont morts ^{2, 3, 4.} Au cours de la phase proliférative de la réaction de régénération, les noyaux des cellules gliales Müller et de leurs cellules progénitrices neuronales dérivées subissent un motif répétitif de migration en phase avec le cycle cellulaire (Interkinetic migration nucléaire, INM) ⁶ </sup > ^7. Nuclei positionné dans le INL basale répliquer leur ADN avant de migrer vers la couche externe nucléaire (ONL) où ils se divisent avant les noyaux résultant retournent basally à l'INL. Ce processus a été décrit pour la première au cours du développement neuroépithélial utilisant des méthodes histologiques, alors que les approches d'imagerie en direct des cellules plus tard confirmé l'interprétation par Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Les deux approches d'imagerie histochimiques et des cellules vivantes ont été utilisées pour déterminer les mécanismes sous – jacents INM et sa fonction dans le développement neuroepithelia y compris la rétine ^{9, 11, 12, 13.} Cependant, les mécanismes régissant INM chez l'adulte régénérant rétine n'a pas été étudiée en profondeurxref "> ^{6, 7.} imagerie des cellules vivantes sera une approche précieuse pour faire progresser notre connaissance des voies de signalisation qui contrôlent l' INM chez l'adulte rétine régénération.

Jusqu'à récemment, l' imagerie des cellules vivantes de l' INM dans la rétine est limitée soit à des embryons de poisson zèbre vivants ou embryon de poulet ou de la souris postnatale explants rétiniens ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Alors que explants rétiniens provenant d' animaux adultes d'une variété d'espèces , y compris la souris, le rat et le poisson zèbre ont été utilisés pour la cellule différente des approches biologiques ^{17, 18, 19, 20,} des expériences d'imagerie des cellules vivantes en utilisant des explants rétiniens have été limité à de brèves périodes de temps et n'ont pas été exécutées en continu pendant plusieurs heures ^{21, 22.} Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture adulte rétines poisson zèbre lumière endommagée pour effectuer des expériences d'imagerie des cellules vivantes INM de surveillance utilisant la microscopie multi-photon ^6. Approches d'imagerie en direct des cellules sont avantageuses par rapport aux méthodes immunohistochimiques lors d' enquêtes sur les mécanismes de contrôle de l' INM, que la dynamique de l' INM, par exemple, les vitesses peuvent être affectées plutôt que l'emplacement de la mitose, ce qui pourrait potentiellement pas être détectée en utilisant immunocytochimie.

À l'avenir, cette méthode a aussi le potentiel d'être modifié pour étudier d'autres processus dynamiques au cours de la régénération de la rétine, comme la phagocytose de mourir photorécepteurs par Müller glie ou le comportement de la microglie.