Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

В отличие от людей, данио (Danio rerio) демонстрируют надежный ответ регенерации на гибель клеток нейронов сетчатки ^{1, 2, 3, 4.} Фактор некроза опухоли α, сигнальная молекула , которая высвобождается от смерти нейронов сетчатки индуцирует Müller глии проживающее в базальном Внутренний ядерный слой (INL) сетчатки, пролиферировать ⁵ и производить нейрональных клеток – предшественников , которые продолжают разрастаться до того дифференцироваться в нейронную клетку типы , которые умерли ^{2, 3, 4.} Во время пролиферативной фазы реакции регенерации, ядра Müller глии и их производные нейрональные клетки – предшественники проходят повторяющиеся миграционную картину в фазе с клеточного цикла (интеркинетического миграции ядер, INM) ⁶ </sup ^{>, 7.} Ядра расположены в базальной INL реплицировать свою ДНК, прежде чем переходить к наружному ядерный слой (ONL), где они делят до того, как возникающие ядра возвращают базально к INL. Этот процесс был впервые описан в ходе нейроэпителиальной разработки с использованием гистологических методов, в то время как методы визуализации живых клеток позже подтвердил толкование Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Обе гистохимические и живых клеток подходы формирования изображений используются для определения механизмов , лежащих INM и его функции в развитии нейроэпителия включая сетчатку ^{9, 11, 12, 13.} Однако механизмы, регулирующие INM во взрослом регенерирующейся сетчатку не были изучены достаточно подробноXref "> ^{6, 7.} живых клеток будет неоценимым подход для продвижения наших знаний о сигнальных путей , которые контролируют INM во взрослом регенерирующей сетчатки.

До недавнего времени живой ячейки изображения INM в сетчатке не был ограничен либо живых эмбрионов данио или к эмбриональной птенца или послеродового мыши эксплантатов сетчатки глаза ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} В то время как эксплантов сетчатки глаза от взрослых животных разных видов , включая мышей, крыс и данио были использованы для различных клетки биологические подходы ^{17, 18, 19, 20,} эксперименты живых клеток с использованием эксплантатов сетчатки глаза гаве были ограничены короткими периодами времени и не выполняется непрерывно в течение нескольких часов ^{21, 22.} Здесь мы описываем подробный протокол к культуре легких поврежденных взрослых данио сетчатке для проведения экспериментов живых клеток изображений INM мониторинга с использованием мульти-фотонной микроскопии ^6. Подходы живых клеток имеют преимущество перед иммуногистохимических методов при исследовании механизмов , контролирующих INM, как динамика INM, например, скорости могут быть затронуты , а не место митоза, который бы не потенциально быть обнаружены с помощью иммуноцитохимии.

В дальнейшем, этот метод также имеет потенциал, чтобы быть модифицирована для изучения других динамических процессов во время регенерации сетчатки, такие как фагоцитоз смерти фоторецепторов Мюллером глии или поведение микроглии.