Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Im Gegensatz zu Menschen, Zebrabärbling (Danio rerio) zeigen eine robuste Regeneration Reaktion auf den Zelltod von retinalen Neuronen ^{1, 2, 3, 4.} Tumor – Nekrose – Faktor α, ein Signalmolekül , das aus sterbenden retinalen Neuronen freigesetzt wird , induziert Müller Glia in der Basalschicht Inner Nuclear Wohnsitz (INL) der Netzhaut ⁵ zu proliferieren und neuronaler Vorläuferzellen erzeugen , die vor Differenzierung in die neuronale Zelle zur Proliferation fortzusetzen Typen , die ^{2 starben, 3, 4.} Während der Proliferationsphase der Regenerierungsreaktion, die Kerne von Müller Glia und deren abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen durchlaufen eine sich wiederholende Migrationsmuster in Phase mit dem Zellzyklus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) ⁶ </sup > ^7. Nuclei positioniert in der basalen INL replizieren ihre DNA vor zu den Äußeren Kernschicht Migration (ONL), wo sie sich teilen, bevor die entstehenden Kerne basal zum INL zurückzukehren. Dieser Prozess wurde erstmals während neuroepithelial Entwicklung mit histologischen Methoden beschrieben, während Live-Cell – Imaging Ansätze bestätigt später die Interpretation von Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Beide histochemische und Live-Cell – Imaging Ansätze verwendet wurden Mechanismen zur Bestimmung zugrunde liegenden INM und seine Funktion bei der Entwicklung von Neuroepithels einschließlich der Netzhaut ^{9, 11, 12, 13.} Jedoch haben die Mechanismen INM im erwachsenen Retina Regenerieren nicht sehr detailliert untersucht wordenxref "> ^{6, 7.} Live-Cell – Imaging wird eine unschätzbare Ansatz sein , unsere Kenntnisse über die Signalwege zu fördern , die INM im erwachsenen regenerierende Retina steuern.

Bis vor kurzem wurde der Abbildung lebender Zellen von INM in der Retina beschränkt auf entweder live Genaktivität oder Hühnerembryonen oder postnatale Maus retinalen Explantate ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Während der Netzhaut Explantate von erwachsenen Tieren aus einer Vielzahl von Arten , einschließlich Maus, Ratte und Zebrabärbling haben für verschiedene zellbiologische Ansätze ^{17, 18, 19, 20,} Live-Cell – Imaging Experimente mit retinalen Explantate ha genutzt wordenve beschränkt Zeiträume zu kurz und nicht kontinuierlich über mehrere Stunden ²¹ ausgeführt worden ist ^{, 22.} Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch Retina Abbildung lebender Zellen Experimente Überwachung INM mit Multi-Photonen – Mikroskopie ⁶ durchzuführen. Live – Cell – Imaging-Ansätze sind vorteilhaft gegenüber immunhistochemischen Methoden , wenn die Mechanismen zu untersuchen INM Controlling, wie die Dynamik des INM, zum Beispiel Geschwindigkeiten betroffen sein könnten , anstatt die Lage der Mitose, die würde möglicherweise nicht mit Immunzytochemie nachgewiesen werden.

In der Zukunft hat dieses Verfahren auch das Potential geändert werden zu studieren andere dynamische Vorgänge bei Netzhautregeneration, wie Phagozytose von Photorezeptoren durch Müller Glia oder das Verhalten von Mikroglia sterben.