Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina ^{1, 2, 3, 4.} Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar ⁵ e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram ^{2, 3, 4.} Durante a fase proliferativa da resposta de regeneração, os núcleos de células da glia Müller e suas células progenitoras neuronais provenientes passam por um padrão repetitivo migratório em fase com o ciclo celular (migração nuclear Interkinetic, INM) ⁶ </sup ^{>, 7.} Núcleos posicionado no INL basal replicar o seu DNA antes de migrar para a camada exterior Nuclear (ONL), onde se dividem antes de retornar os núcleos resultantes basalmente para o INL. Este processo foi descrito pela primeira vez durante o desenvolvimento neuroepithelial usando métodos histológicos, enquanto abordagens de imagens ao vivo de células mais tarde confirmado a interpretação por Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Ambas as abordagens de imagem histoquímicos e em células vivas, foram usadas para determinar os mecanismos subjacentes INM e a sua função no desenvolvimento neuroepithelia incluindo a retina ^{9, 11, 12, 13.} No entanto, os mecanismos que regem INM no adulto regenerar retina não foram estudadas em grande detalhexref "> ^{6, 7.} imagens ao vivo de células será uma abordagem de valor inestimável para avançar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização que controlam o INM na retina regenerar adulto.

Até recentemente, a criação de imagens de células vivas de INM na retina foi limitada a qualquer embriões de peixe-zebra ao vivo ou para pinto embrionário ou o rato pós-natal explantes de retina ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Enquanto explantes de retina de animais adultos de uma variedade de espécies, incluindo ratinhos, ratos e peixes-zebra foram utilizadas para diferentes células abordagens biológicas ^{17, 18, 19, 20,} experimentos com imagens em células vivas a partir de explantes de retina have sido restrita a breves períodos de tempo e não foram executadas de forma contínua ao longo de várias horas ^{21, 22.} Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura adultos retinas de peixe-zebra danificado de luz para realizar experimentos com imagens em células vivas, monitoramento INM usando microscopia multi-fotão ^6. Abordagens de imagem de células vivas são vantajosos em relação aos métodos de imuno-histoquímica ao investigar os mecanismos que controlam INM, como a dinâmica do INM, por exemplo, as velocidades podem ser afetadas em vez de a localização da mitose, o que não seria potencialmente ser detectada usando imunocitoquímica.

No futuro, este método tem também o potencial de ser modificado para estudar outros processos dinâmicos durante a regeneração da retina, tais como fagocitose de morrer fotorreceptores por Muller glia ou o comportamento da microglia.