根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

側根はイメージングチャンバー内で生理的速度で成長する。 （ 図2A 、左、ムービー1、n = 23）、成長速度を、同じ寒天固化培地を含有する標準ペトリプレート上で生育させた側根のものと比較した（ 図2 2A 、右、映画2、n = 23）。成長率は、根の長さが成長と増殖の領域がますます長くなるために決定要因の1つである、側方の根の間でかなり変化する可能性がある13 。したがって、横方向の根のセットは、画像化チャンバおよび寒天プレートの両方において、異なる初期長さ（50μm〜1150μmの範囲）の根を表すように選択された。実験開始時の平均横根の長さ各セット（439および442μmのイメージングチャンバおよびプレートそれぞれ）において同様であった。分析された27時間の時間間隔で、横方向の根の成長は、イメージングチャンバーおよびプレートの両方において、プレート上で52μm/ h（R 2 = 0.997）およびイメージングチャンバーで51μm/ hの平均成長速度R 2 = 0.993）（ 図2B ）。プレートとイメージングチャンバー（ 図2C ）の両方で高度に変動する個々の側根の成長速度は、イメージングチャンバーでは17μm/ hから82μm/ h、プレートでは13μm/ hから87μm/ hの範囲である。成長速度は根の長さと共に一般に増加したが、成長速度は同様の長さの根の間で実質的に変化したが、変動はイメージングチャンバおよびプレートにおいて同様であった。 側根はイメージングチャンバー内で増殖し、hiを用いて画像化することができるgh開口数の目標。 血漿膜マーカーNPSN12-YFP14および微小管マーカーUBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6（RFP-TUB6） 15を同時発現する側方の根をCLSM10によって1時間間隔で画像化して、画像化チャンバー中の細胞増殖中の微小管挙動を記録した（ 図2D 、映画3）。これらのチャンバーでは、外側の根は、x、y、z軸上の位置が非常に安定しており、数時間にわたって連続的な時間経過共焦点スタックを得ることができました。プレプロバースバンド（ 図2D 、緑矢印）、有糸分裂スピンドル（ 図2D 、白矢印）、および線条体（ 図2D 、青矢印）の形成から明らかなように、分裂細胞は連続的に増殖した。ペトリ皿の実生と同様に、イメージングチャンバー内の完全に伸長した根細胞は根毛を開始した（ 図2A 、 図2D 、矢頭）。広い視野を提供するために、 図2Dの画像は20x / 0.7NAの対物レンズで得られた。高開口数の63x / 1.2NA水浸対物レンズ（ 図2E ）を使用して側根の高解像度画像を得ることも可能であった。 側根の成長は、画像化チャンバ内で3日間まで持続する。 イメージングチャンバーが生理的速度で横方向の根の成長をどれくらいの期間サポートできるかを調べるために、イメージングチャンバー（n = 27）およびプレート（n = 33）における側根の長さを0時間、24時間、48時間および72時間で定量した。ルーツ・チョウsenは、0時間で200μmより短く、平均横方向の長さは画像化チャンバで117μm、プレート上では121μmであった。より短い根は平均してよりゆっくりと成長するので（ 図2C ）、それらは寒天平板の縁部であまり成長せず、画像化が容易であった。最初の48時間で、すべての側根の平均成長は、ペトリプレートと比較して、イメージングチャンバーで有意に異ならなかった（ 図3A ）。しかし、平均成長は48時間と72時間との間で有意に低下した（ 図3A ）。成長速度は、48時間後のイメージングチャンバでは一般的に減速すると思われるが、個体間の成長速度は非常に変化し易い（ 図3B 、 3C ）。これは、プレートおよびチャンバー上で同等の速度で成長する側根の実質的なサブセットが存在することを意味する完全な72時間の成長期間にわたって。成長した33個の側根のうち23個（69.7％）は、72時間（927〜3,163μmの間、 図3B 、赤色）の平均長さの1標準偏差以内の長さに達する。イメージングチャンバー内の横方向の根は、この間隔内の長さに達する（ 図3B 、赤色）27のうちの10/27（37.0％）。 イメージングチャンバーは、より古い側方の根、主な根および胚軸に容易に適合させることができる 。 元のイメージングチャンバー設計の限界の1つは、硬い寒天スラブがいくらかの機械的耐性を提供する一方で、重力によって成長する根は最終的に寒天スラブに浸透し、画質の損失をもたらし（ 図4B ）、高NA比較的長い作動距離（0.3mm）の63X / 1.3 NA CS2対物レンズでさえも、若い側方の根は、それらは最初にイメージングチャンバー（ 図2E ）でカバースリップと平行に成長した。それらがより長く成長し、コルミラおよび顎石が形成されるにつれて、側根は増加する陽性重力作用を示し、一方、一次根は発芽後に強い重力応答を示す。これは、一次根を画像化することができる期間を数時間に制限し、48時間以上連続して画像化できる側根の開始長さを厳しく制限する。この制限を克服するために、寒天スラブの表面上の浸透障壁として作用するセルロースセロファン膜によって、カバースリップと平行に成長が維持されるように、チャンバーを改変した（ 図4A ）。 1.5％寒天スラブを用いた最初の試みは、おそらく機械的ストレスのために最初の24時間以内に根の成長を減少させた。スラブ中のより低い寒天濃度を試験した。0.8％の寒天およびセルロースフィルムを含むスラブを有するチャンバーでは、若い側根成長速度は、最初の48時間の従来のチャンバーにおける成長速度と有意に異ならないことが分かった。 0-24時間の間、セルロースチャンバーおよび従来のチャンバーにおける平均根の成長はそれぞれ242μmおよび262μmであり（p = 0.78スチューデントt検定）、24-48時間は330μmおよび355μmであった（p = 0.67スチューデントズt検定）; n = 12、n = 11である。この配置は、効果的にカバーグラスから寒天へと横方向の根が成長するのを防ぎ、さらに48時間まで一次根のイメージングを可能にした（ 図4C ）。 画像化チャンバーが根以外の臓器に適合できるかどうかを試験するために、 シロイヌナズナ胚軸を選択した。胚軸は実質的に根よりも厚いので、従来のイメージングチャンバでは、最上部のcellsはカバースリップに押し付けられ、変形を引き起こした。したがって、中央に楕円形のくぼみを含む空洞スライドを使用して、別の設計が開発された（ 図4D ）。この構成では、厚さ1mmの寒天スラブ（前記2.2と同様に調製）をスライドキャビティ内に数mm突出した一端に配置した（ 図4D ）。スライド中の窩の上に胚軸を配置し、根元を水平部分の上に配置した。これにより、苗が根で宇宙に固定されていたが、胚軸は押しつぶされなかった。プレートと比較して、チャンバー内の成長速度は系統的に定量化されなかったが、イメージングチャンバー内の胚軸は、胚軸（ 図4E 、 4F ） 16の上方に移動する、十分に記述された縦方向成長の波を示した。 <img alt="図1"class = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg" /> 図1 ：イメージングチャンバの組み立て。すべての詳細は本文に記載されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 図2 ：イメージングチャンバー内の生理的条件下で側根が成長する。 （ A ）イメージングチャンバー（左）およびプレート（右）上の25時間にわたるアラビドプシス側根発達（一定光、水平インキュベーション、同時イメージング）。スケールバー=200μm。 （ B ）（ A ）に示すように、側根の長さを27時間（1時間間隔で測定）以上に示すプロット。個別灰色にプロットされた根（プレートおよびイメージングチャンバーについてはn = 23）、赤色の円としての平均長さ。エラーバー= 1SD。赤い線は平均的な長さに線形にフィットします。 （ C ）初期長さに対する（ B ）に示されるすべての側根に対する平均成長率を示すプロット。 （ D ）連続する時点でNPSN12-YFPおよびRFP-TUB6を発現する側方の根から得られた3D共焦点スタックの最大強度予測。 Inset：ボックス領域の拡大。緑色の矢印：プレプロファーゼバンド;白い矢印：紡錘体。青い矢印：phragmoplasts; arrowheads：根毛。 （ E ）0時間および16時間における63X / 1.2NA対物レンズおよびナイキストサンプリング（ピクセル寸法77nm×77nm）を用いて、（ D ）に示すトランスジェニックラインの若い側根から得た高解像度画像の最大強度投影。 h;アスタリスクは、各時点で同一の細胞を突き止める。矢印は、0hと16hとの間で分割するセルを示す。スケールバー=50μm（AC）。 20μm（E）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 図3 ：イメージングチャンバーにおける長期的な側方根の発達。 （ A ）プレートと比較して、撮像チャンバー内で3つの連続した24時間間隔で平均絶対根の成長を示すプロット。 nsはp> 0.05を示す。 ***はp <0.001（スチューデントt検定）を示す。 n = 33（プレート）およびn = 27（イメージングチャンバ）。 （ B ）（A）で使用したすべての根の連続した時点での側根の長さを示すプロット。赤：プレート上に生育したすべての側根の平均の1SD内の最終長さを有するすべての側根（927〜3163μmの間）。 （ C ）最大値72時間を超える連続した時点で取得された側方の根における血漿 – 膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックの高密度投影。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 図4 ：イメージングチャンバーは、他の植物器官に適応させることができます。 （ A – C ）主な根のためのイメージングチャンバー適応。 （ A ）イメージング・チャンバ設計の概略図。これは、MS培地スラブが1.5％寒天の代わりに0.8％寒天を含有し、寒天と植物の間にセルロースフィルム（赤色）を入れて増殖を防止するという2つの変更点を除いて、標準的なデザイン（ 図1 ）寒天に加える。 （ B ）従来のイメージングにおいて0時間および48時間で撮像された7日齢実生の一次根における血漿膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックのXY（上）およびXZ（下）最大強度投影図チャンバー。その根は、その重力応答のために寒天に成長することに注意してください。 （ C ）画像化において0時間および48時間で画像化された7日齢実生の一次根における血漿膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックのXY（上）およびXZ（下）最大強度投影図セルロースフィルムを有するチャンバー。適用前に、セルロースフィルムを80％エタノール中で滅菌し、液体の1 / 2MS培地に浸漬した。寒天への根の重力による成長が防止されることに留意されたい。 （ D – F ）イメージングチャンバーの胚軸への適応。 （ D ）胚軸イメージングチャンバー設計を示す概略図。ポリ（ジメチルシロキサン）ガムガスケット（灰色）は、2つのガラスストリップ（黄色）間の空洞スライド上の赤色。 1.5％の寒天平板（ベージュ）をスライド上に置き、部分的に空洞に到達させる。チャンバはPFD（青色）で満たされている。胚軸が寒天の水平部分に置かれている間に、胚軸が空洞内の寒天スラブの下向きの傾斜領域を占めるように、苗を寒天スラブ上に置く。チャンバーをカバースリップで閉じます。 （ E ）2日苗の胚軸における、血漿 – 膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックの最大強度予測は、連続時間点で48時間以上撮像した。 （ F ）（E）に示す胚軸の根底から頂端軸（Eに示す軸に沿って0時間の相対位置）に沿った個々の細胞の2つの連続する時間間隔における縦方向の成長。胚軸16の上に移動する前述の成長波に注意してください。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 映画1： この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。 映画2： この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。 映画3：し てくださいこの映画をダウンロードするにはここを舐めてください。