חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח
Summary
מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.
Abstract
כמה היבטים של פיתוח צמחים, כגון מורפוגנזה שורש לרוחב, להתרחש על פני זמן של כמה ימים. כדי לחקור את התהליכים הבסיסיים התאים הסלולר, זמן ברזולוציה גבוהה לשגות אסטרטגיות מיקרוסקופיה כי לשמר תנאים פיזיולוגיים נדרשים. רקמות הצמח חייב להיות מזין נאותה אספקת מים עם חילופי גזי מתמשכת אבל, כאשר שקוע משותק תחת coverslip, הם רגישים במיוחד anoxia. אסטרטגיה אחת אשר הועסק בהצלחה היא השימוש במערכת זלוף כדי לשמור על אספקה מתמדת של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, הסדרים כאלה יכול להיות מסובך, מסורבל, ודורשים ציוד מיוחד. מוצג כאן היא אסטרטגיה חלופית עבור מערכת הדמיה פשוטה באמצעות perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. מערכת זו היא קלה להתקנה, דורש ציוד מינימלי, והוא רכוב בקלות על הבמה מיקרוסקופ, המאפשר מספר חדרי הדמיה להיות מוגדר הדמיה שווהאלל. במערכת זו, שיעורי הצמיחה שורש לרוחב הם נבדלים משיעורי צמיחה בתנאים סטנדרטיים על צלחות אגר במשך היומיים הראשונים, וצמיחה שורש לרוחב ממשיך בשיעורים מופחתים לפחות עוד יום. רקמות הצמח מסופקים עם חומרים מזינים דרך אגר לוח זה יכול לשמש גם כדי לנהל מגוון של תרכובות פרמקולוגיות. המערכת הוקמה כדי לפקח על התפתחות שורש לרוחב, אבל הוא להתאמה בקלות התמונה איברים צמח אחרים כגון hypocotyls השורשים העיקריים.
Introduction
כדי לחקור את התהליכים הסלולר והתת-קרקעיים המונחים ביסוד פיתוח הצומח, יש ביקוש גובר לפתרונות הדמיה לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה. האתגר העיקרי בניסויים הדמיה כזו היא שמירה על תנאים פיזיולוגיים כולל חילופי גזי מספיק בתוספת אספקת מים וחומרים מזינים 1 , 2 , 3 . כדי לנצל את היעדים עם פתחים מספריים גבוהים עבור רזולוציה אופטית אופטימלית, דגימות צריך להיות ממוקם בקירבה מקבילה בכיוון מקביל coverslip. התנועה x, y, ו- z כיוונים צריך אידיאלי להיות מינימלי במהלך הדמיה.
בעוד שתילים הם רכוב לעתים קרובות במים או תמיסה מימית עבור הדמיה לטווח קצר, מים יש קיבולת נמוכה עבור המסת CO2 ו O 2 (1.54 מ"ג / מ"ל ו 0.04 מ"ג / מ"ל, בהתאמה ב 20 ° C, 0.1 מגפ"ס) 4 , מה שהופךזה לא מתאים עבור זמן ארוך לשגות ניסויים. מערכות זלוף כי לשמור על רמות קבועות של חמצן וחומרים מזינים הם פתרון אחד לבעיה זו פותחו עבור מיקרוסקופיה לייזר סריקה confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 ו מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) 5 . מערכות כמו RootChip 2 ו RootArray 3 תוכננו במיוחד עבור זמן לשגות הדמיה של השורשים המתפתחים לערב נביטה זרעים במודל מותאם אישית לבנות רב הדגימה. סידורים אלה מבטיחים הפרעה מכנית מינימלית ומעוצבים לניתוח מקבילי של שתילים מרובים, אך אינם מותאמים להדמיה של מבנים תת-תאיים. קאלדר ועמיתיו עיצבו תא מורכבת יותר זלוף מבוסס הדמיה אופטימיזציה עבור הדמיה של מבנים subcellular שבו הדגימה מוחזקת בעמדה על ידי רשתכדי לאפשר את השימוש של עדשות טבילה הגדלה גבוהה 1 .
הציג כאן פתרון חלופי, פשוט לבעיה זו אשר אינו מבוסס על מערכות זלוף, אך מנצל perfluorodecalin (PFD), perfluorocarbon כי זכה לאחרונה הפופולריות כמדיום גובר עבור הדמיה ארבידופסיס 6 , 7 , 8 . ביישומים כאלה, קיבולת גבוהה של PFD עבור המסת CO 2 ו O 2 (1.9 גרם / מ"ל עבור O 2 ב PFD לעומת 0.04 מ"ג / מ"ל במים) 9 , מאפשר החלפת גזי ידי הרקמה שקוע. יתר על כן, PFD הוא לא פלואורסצנטי ומדד השבירה שלו (1.313) הוא דומה לזה של מים (1.333) והוא קרוב יותר לזה של cytosol (~ 1.4) מאשר אוויר (1.000) 6 . Fluluorocarbons דווחו יש השפעה מינימלית פיזיולוגית על מגוון רחב של צמחים צמח לאבעיות 6 , עם זרעי צנון נובטים בקלות כאשר שקוע PFD ומציג צמיחה נורמלית ופיתוח לפחות שני ימים מלאים, כאשר מסופק עם מים 10 . תצפיות דומות נעשו עבור נביטה של זרעי ארבידופסיס . בהתבסס על גירוי ראמאן פיזור ישיר לתמונה הפצה של PFD ב רקמות ארבידופסיס עלה לאחר חדירת, ליטג'ון ועמיתיו למסקנה כי PFD סביר להניח לא נלקח על ידי תאים חיים 8 . PFD בעבר שימש בעיקר כדי התמונה רקמות אוויר, שבו זה מגדיל באופן משמעותי את עומק הדמיה כפי שהוא בקלות חדירת מרחבי האוויר עקב מתח נמוך שלה משטח 6 . הנה, PFD הוא אימץ עבור הדמיה confocal לטווח ארוך של פיתוח שורשים לרוחב. בתצורה זו, שתילים אחד או יותר ממוקמות על לוח של בינונית צמיחה מוצק עם אגר ו שקוע PFD. PFD מאפשר gחילופי אדים בתא הדמיה, מניעת anoxia. PFD הוא נדיף מאוד ולכן הוא נשמר על ידי אטם של מסטיק פולי (dimethylsiloxane), כי יש גם חדירות גז גבוהה (1.5 x 10 -12 pmol מ -1 -1 s -1 אבא -1 עבור CO 2 ) 11 . חומרים מזינים ומים מסופקות על ידי לוח של solidified בינוני עם אגר. במקביל, זה לוח אגר בעדינות לוחץ את השורש נגד coverslip, ובכך לתקן את המיקום היחסי שלה בחדר הדמיה ומאפשר את השימוש ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יתר על כן, לוח אגר ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון של טיפולים תרופתי, כולל dexamethasone, oryzalin, ו isoxaben. תאי הדמיה ניתן להרכיב במספרים גדולים מן שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות ציוד מינימלי. תאי ההדמיה פותחו ואופיינו ללימוד התפתחות שורש לרוחב, אך ניתנים להתאמה לדמיית איברים אחרים, כגון שורש ראשוני,היפוקוטילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה הדמיה confocal של פיתוח שורשים לרוחב עבור שניים עד שלושה ימים. בתקופות של עד 48 שעות, לא נצפו תופעות לוואי של מערכת ההדמיה על התפתחות שורש לרוחב. לאחר 48 שעות, הצמיחה השורשית הממוצעת החלה להאט, אם כי תת-קבוצה משמעותית של השורשים (37%) המשיכה לצמוח בקצב דומה לצמיחת השורש הממוצעת בצלחות. לכן, באמצעות הדמיה מספר גדול מספיק של שורשים, שורשים אשר הצמיחה איטית לאחר 48 שעות ניתן להרחיק. בדיקות סיסטמטיות של תאי ההדמיה לא בוצעו לתקופות ארוכות יותר מ -72 שעות, אך מומלץ להשתמש באסטרטגיות חלופיות אם יש צורך בתקופות הדמיה מורחבות. תאי הדמיה עשויים להישאר על הבמה מיקרוסקופ ברציפות, אם בתנאי הסביבה מתאימים מסופקים, או מוסר למתקן הצמיחה ומדי פעם חזר למיקרוסקופ. זה מאפשר חדרים רבים להיות צילמו במקביל/ P>
אחד היתרונות של החדרים המתוארים כאן הוא כי שורשים לרוחב קבועים במצבם והוא יכול להיות צילמו באמצעות ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יציבות מרחבית ביקורתית תלוי ריכוז אגר בשימוש לוח אגר תמיכה. בתחילה נבדקו ריכוזים שונים של אגר 0.8% ל אגר של 2%, ומצאו כי ריכוזים גבוהים בטווח זה קבועים בשורשים קבועים בחלל, אך שורש הצמיחה הואט מהר יותר וחלק מהשורשים הראו סימני לחץ מכני, כולל התארכות תא מופחתת. לעומת זאת, ריכוזי אגר נמוכים לא סיפקו את התמיכה והשורשים הנדרשים ב- x, y ו- z במהלך ההדמיה. אופטימלית 1.5% אגר לוח מתקן את המיקום של הדגימה ללא תופעות מכניות שליליות. בתנאים אלה, לאחר ההתיישבות ב 30 דקות הראשונות או כך, שורשים יציבים על פני שעות רבות, המאפשר רכישת נתונים לילה. במהלך רכישת נתוני 4D, טווחי ערימת z היו בדרך כלל במחוררים על ידי 5-10 מיקרומטר נוסף אבל זה היה בעיקר כדי להתאים לצמיחה מחוץ לגובה של שורשים לרוחב ולא z- להיסחף או לנענע. למרות ריכוז אגר סטנדרטי מספק התנגדות מסוימת נגד חדירה, שורשים gravitropically גדל בסופו של דבר לחדור את אגר. עם זאת, באמצעות שינוי קטין של החדר הדמיה, שורש הצמיחה יכולה להישמר מקביל coverslip, המאפשר שורשים לרוחב מבוגר השורשים העיקריים להיות צילמו. יתר על כן, חדר הדמיה בסיסי יכול בקלות להיות מותאם אישית עבור hypocotyls. Hypocotyls הם יותר חופשי צף במערכת זו כך Z- ציר סוגר לרכישת התמונה הוגדלה בדרך כלל על 20 מיקרומטר. במחקר זה, מיקרוסקופ זקוף שימש בכל רחבי, אשר אפשרה את מאפייני המצע להיות נשלט. תא הדמיה יכול להיות מותאם לתצורות מיקרוסקופ הפוכה אבל ההשפעה תלוי זמן של coverslip נוקשה על מיירט איברים יהיה צורך להעריך. </p>
Littlejohn ועמיתיו יש לציין כי PFD עצמו אינו בקלות להמיס מולקולות ביולוגיות, כלומר זה לא ניתן להשתמש עבור ישירות עבור משלוח של תרכובות פרמקולוגיות 7 . בעיה זו היה להתגבר על ידי אספקת תרכובות כאלה דרך לוח של המדידה הצמיחה מוצק שבו מוטלת אגר. בעוד מערכות זלוף יישארו השיטה של בחירה עבור לשטוף- out ניסויים, תא הדמיה שימש בהצלחה עבור ניהול של dexamethasone 12 ותרכובות אחרות. הערה אחת, בעוד מאמר זה היה בהכנה פון Wagenheim ועמיתיו 18 תיאר חדר הדמיה פיתוח שורש לרוחב באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופ 'ג' פרי ווסטנייס, אוניברסיטת בריטיש קולומביה, על זרע להביע RFP-TUB6 ו סוקר אנונימי עבור תיקונים מועיל. אנו אסירי תודה לפרופ 'יו דיקינסון על כך שהזהיר אותנו להשתמש בסרט תאית כתמיכה מכנית ולג'ון בייקר לצילום. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר BBSRC מעניק BB / G013993 / 1 ו- BB / D004055 / 1 ל- IM, וכן פרס BBSRC הדרכה דוקטורנט מלגות קלרנדון CK
Materials
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc | |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
