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Developmental Biology

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Published: May 17, 2017
doi:
10.3791/55331
,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford

Summary

Se presenta aquí una técnica simple para la alta resolución confocal time-lapse imágenes de desarrollo de raíces e hipocótilo por hasta 3 días utilizando objetivos de alta apertura numérica y perfluorodecalin como medio de inmersión.

Abstract

Varios aspectos del desarrollo de las plantas, como la morfogénesis de la raíz lateral, se producen en intervalos de tiempo de varios días. Para estudiar los procesos celulares y subcelulares subyacentes, se requieren estrategias de microscopía de lapso de tiempo de alta resolución que preserven las condiciones fisiológicas. Los tejidos vegetales deben tener un suministro adecuado de nutrientes y agua con intercambio gaseoso sostenido, pero cuando son sumergidos e inmovilizados bajo una cubreobjetos, son particularmente susceptibles a la anoxia. Una estrategia que se ha empleado con éxito es el uso de un sistema de perfusión para mantener un suministro constante de oxígeno y nutrientes. Sin embargo, tales arreglos pueden ser complicados, engorrosos y requieren equipo especializado. Se presenta aquí una estrategia alternativa para un sistema de imagen simple que utiliza perfluorodecalina como medio de inmersión. Este sistema es fácil de instalar, requiere un equipo mínimo, y se monta fácilmente en una etapa de microscopio, permitiendo que varias cámaras de imagen se establezcan y formen imágenes en parAlelo En este sistema, las tasas de crecimiento de las raíces laterales son indistinguibles de las tasas de crecimiento en condiciones estándar en placas de agar durante los dos primeros días, y el crecimiento de las raíces laterales continúa a tasas reducidas durante al menos otro día. Los tejidos de las plantas se suministran con nutrientes a través de una losa de agar que se puede utilizar también para administrar una gama de compuestos farmacológicos. El sistema se estableció para monitorear el desarrollo de la raíz lateral, pero es fácilmente adaptable a la imagen de otros órganos de la planta tales como hipocótilos y raíces primarias.

Introduction

Para estudiar los procesos celulares y subcelulares que subyacen en el desarrollo de las plantas, existe una creciente demanda de estrategias de imagen de larga duración a largo plazo. Un desafío clave en tales experimentos de formación de imágenes es el mantenimiento de condiciones fisiológicas incluyendo suficiente intercambio gaseoso más un suministro de agua y nutrientes 1 , 2 , 3 . Para utilizar objetivos con aberturas numéricas elevadas para una óptima resolución óptica, los especímenes deben colocarse en estrecha proximidad y orientados paralelamente a la cubreobjetos. El movimiento en las direcciones x, y y z debería idealmente ser mínimo durante la obtención de imágenes.

Mientras que las plántulas a menudo se montan en agua o solución acuosa para imágenes a corto plazo, el agua tiene una baja capacidad para disolver CO 2 y O 2 (1,54 mg / mL y 0,04 mg / mL, respectivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , que haceNo es adecuado para experimentos de lapso de tiempo prolongado. Los sistemas de perfusión que mantienen niveles constantes de oxígeno y nutrientes son una solución a este problema y se han desarrollado tanto para microscopía confocal de barrido láser (CLSM) 1 , 2 , 3 como para microscopía de lámina (LSM) 5 . Sistemas como el RootChip 2 y el RootArray 3 han sido diseñados específicamente para imágenes de lapso de tiempo de desarrollo de raíces e implican la germinación de semillas en un dispositivo multi-espécimen personalizado. Estas disposiciones garantizan una mínima perturbación mecánica y están diseñadas para el análisis paralelo de plántulas múltiples, pero no se optimizan para la obtención de imágenes de estructuras subcelulares. Calder y sus colegas han diseñado una cámara de imagen de perfusión más complicada optimizada para la obtención de imágenes de estructuras subcelulares en las que la muestra se mantiene en posición mediante una mallaPara permitir el uso de lentes de inmersión de alta ampliación 1 .

Se presenta aquí una alternativa, simple solución a este problema que no se basa en sistemas de perfusión, pero utiliza perfluorodecalin (PFD), un perfluorocarbono que recientemente ha ganado popularidad como un medio de montaje de Arabidopsis imágenes 6 , 7 , 8 . En tales aplicaciones, la alta capacidad de PFD para disolver CO 2 y O 2 (1,9 g / mL para O 2 en PFD en comparación con 0,04 mg / mL en agua) 9 , permite el intercambio gaseoso por el tejido sumergido. Además, el PFD no es fluorescente y su índice de refracción (1.313) es comparable al del agua (1.333) y está más cerca del del citosol (~ 1.4) que del aire (1.000) 6 . Se ha reportado que los perfluorocarbonos tienen un efecto fisiológico mínimo en una variedad de plantas y plantas.Cuestiones 6 , con las semillas de rábano germinando fácilmente cuando sumergido en PFD y que muestra un crecimiento normal y el desarrollo de al menos dos días completos cuando se suministra con agua [ 10] . Observaciones similares se han hecho para la germinación de semillas de Arabidopsis [ 6] . Basado en la dispersión Raman estimulada para imagen directamente la distribución de PFD en tejidos de hoja de Arabidopsis después de la infiltración, Littlejohn y colegas concluyen que el PFD probablemente no es tomado por las células vivas [ 8] . PFD se ha utilizado previamente predominantemente a la imagen de los tejidos aéreos, donde aumenta significativamente la profundidad de la imagen ya que fácilmente infiltra espacios de aire debido a su baja tensión superficial [ 6] . Aquí, PFD se adopta para la imagen confocal a largo plazo de desarrollar las raíces laterales. En esta configuración, se colocan una o más plántulas sobre una losa de medio de crecimiento solidificado con agar y sumergida en PFD. El PFD permite gAseo en la cámara de imagen, evitando la anoxia. El PFD es altamente volátil por lo que es retenido por una junta de goma de poli (dimetilsiloxano) que también tiene alta permeabilidad al gas (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 para CO 2 ) 11 . Los nutrientes y el agua son suministrados por la losa de medio solidificado con agar. Al mismo tiempo, esta placa de agar presiona suavemente la raíz contra la cubreobjetos, fijando así su posición relativa en la cámara de formación de imágenes y permitiendo el uso de lentes de inmersión en agua de alta resolución. Además, la placa de agar puede utilizarse para administrar una gama de tratamientos farmacológicos, incluyendo dexametasona, orizalina e isoxabeno. Las cámaras de formación de imágenes se pueden ensamblar en grandes cantidades a partir de diapositivas de microscopía estándar utilizando un equipo mínimo. Las cámaras de imagen se desarrollaron y caracterizaron para estudiar el desarrollo de la raíz lateral, pero son adaptables a la imagen de otros órganos de plántulas, tales como puntas de raíz primaria yHipocótilos.

Protocol

1. Creación de la Cámara Utilizando un cortador de vidrio, corte tiras de 3 mm de ancho desde el extremo de un portaobjetos de microscopio de 1 mm de espesor. Usando un cianoacrilato super-pegamento o cinta de doble cara, pegue estas tiras de vidrio aproximadamente 45 mm de separación a través de la anchura de una segunda diapositiva de microscopio ( Figura 1A ). Se requiere una diapositiva por cámara, además de diapositivas adicionales para verter placas de agar (una diapositiva producirá 2-3 placas de agar). Las diapositivas pueden reutilizarse. Entre las tiras de vidrio, formar una junta de idéntica altura de la goma de poli (dimetilsiloxano) permeable a los gases. Colocar una bola de goma de poli (dimetilsiloxano) en la diapositiva ( Figura 1B ), mojar una segunda diapositiva con una pequeña cantidad de etanol absoluto al 100% y aplastar la bola de goma de poli (dimetilsiloxano) con la segunda diapositiva hasta que haya alcanzado la altura De las tiras de vidrio ( Figura 1C ). Si es necesario, recorte el exceso de poli (dimeTilsiloxano) con una cuchilla de afeitar y repetir el aplanado. Utilizando una cuchilla adecuada o una cuchilla de afeitar mojada en etanol absoluto, retire la parte interior de la goma de poli (dimetilsiloxano) para crear la cavidad que posteriormente sujetará la plantilla y la placa de agar ( Figura 1D ). Cuidadosamente recortar el gel con una cuchilla de afeitar para crear una junta con un espesor de pared final de aproximadamente 2 mm ( Figura 1E ). La permeabilidad de los gases a través de una barrera de poli (dimetilsilaxano) es independiente de espesores superiores a 50 μm 11 . 2. Creación de la losa solidificada con agar de medio de crecimiento En una diapositiva microscópica con dos tiras de vidrio, coloque un cubreobjetos (22 mm x 50 mm) de modo que se apoye en ambas tiras de vidrio. Pipetear el medio de crecimiento de Murashige y Skoog de media fuerza fundido que contiene sacarosa al 1% p / v y agar al 1,5% p / v (½ MS) en el espacio resultanteDebajo del cubreobjetos hasta que este último esté completamente lleno (aproximadamente 1 ml de volumen total) y dejar hasta que el agar se establezca (aproximadamente 5 min). Nota: Los compuestos farmacológicos pueden administrarse a través de la losa de agar mediante la adición de concentraciones apropiadas al medio líquido antes de verter la losa. Esto se probó con éxito para dexametasona 12 , isoxabeno, 2,6-diclorobenzonitrilo (DCB), orizalina y latrunculina B. 3 . Finalización de la configuración de la cámara El aire equilibra el PFD agitando un pequeño volumen de PFD en un tubo 7 . Añadir una pequeña cantidad (aproximadamente 200 μl) de PFD con equilibrio de aire al pocillo de la junta de gel, pero no llene completamente la cámara. Este PFD ayudará a evitar el atrapamiento de burbujas de aire bajo la placa de agar mientras se coloca en la cámara. Retire el cubreobjetos de la losa de agar (en el paso 2.2 anterior) y utilice una cuchilla de afeitar para cortar una porción deTamaño y forma. Luego colóquelo en el pocillo de la junta de gel ( Figura 1F ). Debe haber un espacio de 2-4 mm a la junta alrededor. Llene completamente la cámara con PFD con equilibrio de aire. Coloque una o más plántulas de A. thaliana (hasta 3 plántulas para la formación de imágenes durante 2-3 días) sobre la placa de agar con los cotiledones e hipocótilo colgando sobre el borde, flotando en PFD ( Figura 1G ). Para obtener plántulas, esterilizar las semillas con etanol al 70%, sembrar en medio ½ MS suplementado con 1% de sacarosa y 0,8% de agar, estratificar durante 2-4 días a 4 ° C y crecer en placas orientadas verticalmente a 22 ° C en un 16 H luz / 8 h régimen oscuro. Para obtener imágenes de raíces laterales, cultivar plantas durante 7-10 días antes de transferir a las cámaras de imagen. Para cerrar la cámara, aplique un cubreobjetos que se adapte a la óptica del objetivo, presionando suavemente hacia abajo con el borde de una diapositiva de microscopio de vidrio hasta que la cubreobjetosSe apoya sobre ambas tiras de vidrio ( Figura 1H ). Asegure el cubreobjetos con tiras de cinta quirúrgica de micropore de 1.25 cm de ancho cortadas a la mitad longitudinalmente en cada extremo si se desea ( Figura 1I ). Deje reposar la muestra durante aproximadamente 30 minutos antes de tomar imágenes. Esto minimiza el movimiento de la muestra durante la obtención de imágenes. Realizar imágenes con un microscopio vertical para mantener un sustrato controlado para el crecimiento. Utilice los objetivos 20X / 0.7NA o 63X / 1.2NA CS2.

Representative Results

Las raíces laterales crecen a velocidades fisiológicas en las cámaras de imagen. Se midieron las longitudes de raíces laterales de las plantas en cámaras de formación de imágenes a intervalos de una hora ( Figura 2A , izquierda, Película 1, n = 23) y se compararon las tasas de crecimiento con las de raíces laterales cultivadas en placas de Petri estándar que contenían el mismo medio solidificado con agar . 2A , derecha, Película 2, n = 23). Las tasas de crecimiento pueden variar considerablemente entre las raíces laterales, siendo la longitud de la raíz un factor determinante debido a las zonas cada vez más largas de crecimiento y proliferación 13 . Por lo tanto, se seleccionaron conjuntos de raíces laterales para representar raíces de diferentes longitudes iniciales (que van desde 50 μm hasta 1150 μm) tanto en la cámara de formación de imágenes como en la placa de agar. Longitud media de la raíz lateral al inicio del experimentoFue similar en cada conjunto (439 y 442 μm para cámaras y placas de imagen, respectivamente). En el intervalo de tiempo analizado de 27 h, el crecimiento de raíz lateral fue aproximadamente lineal tanto en cámaras de imagen como en placas, con una tasa de crecimiento promedio de 52 μm / h (R 2 = 0,997) en placas y 51 μm / h en cámaras de imagen R $ ₂ $ = 0,993) ( Figura 2B ). Las tasas de crecimiento de las raíces laterales individuales son muy variables tanto en placas como en cámaras de imagen ( Figura 2C ), que van desde 17 μm / h hasta 82 μm / h en cámaras de imagen y de 13 μm / h a 87 μm / h en placas. Aunque las tasas de crecimiento generalmente aumentaron con la longitud de la raíz, las tasas de crecimiento todavía variaron sustancialmente entre las raíces de longitud similar, pero la varianza fue similar en las cámaras de imagen y en las placas. Las raíces laterales proliferan en cámaras de imagen y pueden serGh objetivos de apertura numérica. Las imágenes de las raíces laterales coexpresando el marcador de la membrana plasmática NPSN12-YFP 14 y el marcador de microtúbulos UBQ1 :: mRFP-TUBULINA BETA6 (RFP-TUB6) 15 fueron documentadas por CLSM 10 a intervalos de 1 h para documentar el comportamiento de los microtúbulos durante la proliferación celular en cámaras de imagen ( Figura 2D , Película 3). En estas cámaras, las raíces laterales eran muy estables en su posición en los ejes x, y y z, permitiendo la adquisición de pilas confocales continuas en lapso de tiempo durante varias horas. Las células meristemáticas proliferaron continuamente, como es evidente a partir de la formación de bandas preprofásicas ( Figura 2D , flechas verdes), haces mitóticos ( Figura 2D , flechas blancas) y fragmoplastos ( Figura 2D , flechas azules). Al igual que con las plántulas en placas de Petri,Las células de raíz completamente alargadas en las cámaras de formación de imágenes iniciaron los pelos radiculares ( Figura 2A , Figura 2D , cabezas de flecha), indicando además que el desarrollo se desarrolló como se esperaba en las cámaras de formación de imágenes. Para proporcionar un amplio campo de visión, las imágenes de la Figura 2D se obtuvieron con un objetivo NA de 20x / 0,7. También fue posible obtener imágenes de alta resolución de raíces laterales utilizando un objetivo de inmersión en agua NA de alta apertura numérica 63x / 1.2 ( Figura 2E ). El crecimiento de la raíz lateral se mantiene en las cámaras de imagen hasta por tres días. Para cuantificar cuánto tiempo las cámaras de imagen podrían soportar el crecimiento de las raíces laterales a velocidades fisiológicas, se cuantificó la longitud de la raíz lateral en cámaras de imagen (n = 27) y en placas (n = 33) a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. Las raíces de choSen eran menores de 200 μm a 0 h, con una longitud media de raíz lateral de 117 μm en cámaras de formación de imágenes y 121 μm en placas. Dado que las raíces más cortas crecen más lentamente en promedio ( Figura 2C ), que creció en el borde de la placa de agar menos a menudo, y eran más fáciles de imagen. El crecimiento promedio de todas las raíces laterales no fue significativamente diferente en las cámaras de imagen en comparación con las placas de Petri en las primeras 48 h ( Figura 3A ). Sin embargo, el crecimiento promedio se redujo significativamente entre 48 h y 72 h ( Figura 3A ). Aunque las tasas de crecimiento parecen ralentizar en general en las cámaras de imagen después de 48 h, las tasas de crecimiento entre los individuos siguen siendo muy variables ( Figura 3B , 3C ), lo que significa que hay un subconjunto sustancial de raíces laterales que crece a tasas comparables en placas y en cámaras Durante el período completo de crecimiento de 72 h. 23 de las 33 raíces laterales cultivadasEn placas (69,7%) alcanzan una longitud dentro de una desviación estándar de la longitud media a 72 h (entre 927 y 3,163 μm, Figura 3B , rojo). 10 de 27 (37,0%) raíces laterales en cámaras de imagen alcanzan una longitud dentro de este intervalo ( Figura 3B , rojo). Las cámaras de imagen se pueden adaptar fácilmente para las raíces laterales más antiguas, raíces primarias e hipocótilo . Una de las limitaciones del diseño original de la cámara de imágenes fue que mientras la placa de agar duro proporcionaba cierta resistencia mecánica, las raíces gravitropicales eventualmente penetraron en la placa de agar, resultando en pérdida de calidad de imagen ( Figura 4B ) y crecimiento más allá de la distancia de trabajo de NA alta Incluso el objetivo relativamente largo de 0,3 mm de distancia de trabajo 63X / 1,3 NA CS2. Las raíces laterales jóvenes carecen del contenido de statolitoColumela células necesarias para el gravitropismo 17 por lo que inicialmente creció paralelo a la cubreobjetos en las cámaras de imagen ( Figura 2E ]. A medida que crecen más y columela y statoliths forman, las raíces laterales muestran aumento gravitropismo positivo, mientras que las raíces primarias muestran una fuerte respuesta gravitrópica desde la germinación en adelante. Esto limita a unas pocas horas el período durante el cual las raíces primarias pueden ser visualizadas y limita severamente la longitud de inicio de las raíces laterales que se pueden visualizar de forma continua durante 48 h o más. Para superar esta limitación, la cámara se modificó de tal manera que el crecimiento se mantiene paralelo a la cubreobjetos por una membrana celulósica de celofán que actúa como una barrera de penetración en la superficie de la placa de agar ( Figura 4A ). Los intentos iniciales utilizando una losa de agar al 1,5% causaron un crecimiento reducido de las raíces en las primeras 24 h, debido quizá al estrés mecánico. Las concentraciones más bajas de agar en la losa se probaronD se encontró que en cámaras con una placa que contenía 0,8% de agar y película de celulosa, las tasas de crecimiento de las raíces laterales jóvenes no difirieron significativamente de las tasas de crecimiento en cámaras convencionales durante las primeras 48 h. Por 0-24 h, el crecimiento promedio de la raíz en las cámaras de celulosa y cámaras convencionales fue de 242 μm y 262 μm respectivamente (p = 0,78 Student t-Test) y durante 24-48 h fue 330 μm y 355 μm 1 respectivamente (p = 0,67 Student's T-Test); N = 12 y n = 11, respectivamente. Esta disposición impidió que las raíces laterales crecieran lejos de la cubreobjetos, en el agar, y también permitió la proyección de imagen de raíces primarias por hasta 48 h ( Figura 4C ). Para probar si las cámaras de imagen se podrían adaptar para órganos distintos de las raíces, se eligieron hipocótilos de Arabidopsis. Los hipocótilos son sustancialmente más gruesos que las raíces, por lo que en la cámara de formación de imágenes convencional,Los ells fueron exprimidos contra la cubreobjetos, llevando a la deformación. Por lo tanto, se desarrolló un diseño alternativo utilizando diapositivas de cavidad que contienen una depresión ovalada en su centro ( Figura 4D ). En esta configuración, se colocó una plancha de agar de 1 mm de grosor (preparada como en el punto 2.2 anterior) con un extremo sobresaliendo unos pocos mm en la cavidad de deslizamiento ( Figura 4D ). Los hipocótilos se colocaron por encima de la cavidad en la diapositiva mientras que la raíz se colocó encima de la parte horizontal. Esto aseguró que la plántula se fijó en el espacio por la raíz, pero el hipocótilo no se aplastó. Mientras que las tasas de crecimiento en las cámaras en comparación con las placas no fueron cuantificados sistemáticamente, hipocotilos en las cámaras de imagen exhibió la ola bien descrita de crecimiento longitudinal migrando hasta el hipocotilo ( Figura 4E , 4F ) [ 16] . <img alt="Figura 1"Class = "xfigimg" src = "/ archivos / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg" /> Figura 1 : Montaje de una cámara de imagen. Todos los detalles se describen en el texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Las raíces laterales crecen bajo condiciones fisiológicas en cámaras de imagen. ( A ) desarrollo de la raíz lateral de Arabidopsis en una cámara de imágenes (izquierda) y en una placa (derecha) durante 25 h (luz constante, incubación horizontal, imágenes simultáneas). Barras de escala = 200 μm. ( B ) Parcela que muestra longitudes de raíces laterales durante 27 h (medidas en intervalos de 1 h), de raíces laterales como se muestra en ( A ). Individual(N = 23 para placas y cámaras de imagen), longitud media en círculos rojos. Barras de error = 1 SD. La línea roja es de ajuste lineal a través de longitudes promedio. ( C ) Parcela que muestra la tasa de crecimiento promedio de todas las raíces laterales mostradas en ( B ) con respecto a su longitud inicial. ( D ) Proyecciones de intensidad máxima de pilas confocales 3D adquiridas a partir de raíces laterales que expresan NPSN12-YFP y RFP-TUB6 en puntos de tiempo consecutivos. Inserción: Ampliación de la región en caja. Flechas verdes: bandas preprofase; Flechas blancas: husos mitóticos; Flechas azules: phragmoplasts; Puntas de flecha: pelos de raíz. ( E ) Proyecciones de intensidad máxima de imágenes de alta resolución adquiridas a partir de una raíz lateral joven de la línea transgénica mostrada en ( D ) usando un objetivo 63X / 1.2 NA y un muestreo de Nyquist (dimensiones de píxel 77 nm x 77 nm) a 0 h y 16 marido; Los asteriscos localizan células idénticas en cada punto de tiempo; Flecha indica una celda que se divide entre 0h y 16 h.Barras de escala = 50 μm (AC); 20 mu m (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Desarrollo de la raíz lateral a largo plazo en cámaras de imagen. ( A ) Parcela que muestra el crecimiento promedio absoluto de la raíz en tres intervalos consecutivos de 24 h en cámaras de formación de imágenes en comparación con las placas. Ns indica p> 0,05; *** indica p <0,001 (prueba t de Student). N = 33 (placas) y n = 27 (cámaras de formación de imágenes). ( B ) Parcela que muestra longitudes de raíces laterales en puntos de tiempo consecutivos en todas las raíces usadas en (A). Rojo: todas las raíces laterales con una longitud final dentro de 1 SD de la media de todas las raíces laterales crecidas en placas (entre 927 y 3163 μm). ( C ) Máximo enTenacidad de las pilas confocal 3D representativas del marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP en las raíces laterales, adquiridas en puntos de tiempo consecutivos durante 72 h. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Las cámaras de imagen pueden ser adaptadas para otros órganos de la planta. ( A – C ) Adaptación de cámara de imagen para raíces primarias. ( A ) Esquema del diseño de cámara de imagen. Esto es idéntico al diseño estándar ( Figura 1 ) aparte de dos modificaciones: la losa de medio MS contiene 0,8% de agar en lugar de 1,5% de agar y una película de celulosa (roja) se coloca entre agar y planta para prevenir el crecimientoEn el agar. ( B ) Proyecciones de máxima intensidad XY (superior) y XZ (inferior) de las pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP en la raíz primaria de una plántula de 7 días de imagen a 0 y 48 h en una proyección de imagen convencional cámara. Tenga en cuenta que la raíz crece en el agar debido a su respuesta gravitrópica. ( C ) Proyecciones de máxima intensidad XY (superior) y XZ (inferior) de las pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP en la raíz primaria de una plántula de siete días de edad reproducida a 0 h y 48 h en la formación de imágenes Con película de celulosa. Antes de la aplicación, la película de celulosa se esterilizó en etanol al 80% y se remojó en medio ½ MS lıquido. Tenga en cuenta que se impide el crecimiento gravitrópico de la raíz en el agar. ( D – F ) Adaptación de cámara de imagen para hipocótilos. ( D ) Esquema que muestra el diseño de cámara de imagen de hipocótilo. Una junta de goma de poli (dimetilsiloxano) (gris) es manufactuRojo en una diapositiva de la cavidad entre dos tiras de cristal (amarillo). Una placa de 1,5% de agar de espesor uniforme (beige) se coloca sobre la corredera, alcanzando parcialmente la cavidad. La cámara está llena de PFD (azul). Las plántulas se colocan sobre la placa de agar de manera que el hipocótilo ocupa la región inclinada hacia abajo de la placa de agar en la cavidad mientras que la raíz está posicionada en la parte horizontal del agar. La cámara se cierra con un cubreobjetos. ( E ) Proyecciones de intensidad máxima de pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP en un hipocótilo de una plántula de dos días de edad reproducida durante 48 horas en puntos de tiempo consecutivos. ( F ) Crecimiento longitudinal en dos intervalos de tiempo consecutivos de células individuales a lo largo del eje basal a apical (posiciones relativas a 0 h a lo largo del eje mostrado en E) del hipocótilo mostrado en ( E ). Obsérvese la ola anteriormente descrita de crecimiento migrando hasta el hipocótilo [ 16] . Barras de escala = 100 μmetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Película 1: Haga clic aquí para descargar esta película. Película 2: Haga clic aquí para descargar esta película. Película 3: Por favor cLame aquí para descargar esta película.

Discussion

El método presentado aquí es una estrategia simple para la imagen confocal de alta resolución de desarrollar raíces laterales durante dos y hasta tres días. Durante períodos de hasta 48 h, no se observaron efectos adversos del sistema de imagen en el desarrollo de la raíz lateral. Después de 48 h, el crecimiento promedio de las raíces laterales comenzó a disminuir, aunque un subconjunto sustancial de las raíces (37%) siguió creciendo a tasas comparables al crecimiento promedio de las raíces en las placas. Por lo tanto, a través de imágenes un número suficientemente grande de raíces, las raíces cuyo crecimiento se ralentiza después de 48 h puede ser excluido. Las pruebas sistemáticas de las cámaras de imagen no se realizaron por períodos de más de 72 h, pero se recomiendan estrategias alternativas si se desean períodos prolongados de formación de imágenes. Las cámaras de formación de imágenes pueden dejarse en la etapa del microscopio continuamente, si se proporcionan condiciones ambientales adecuadas, o se retiran a una instalación de crecimiento y se devuelven periódicamente al microscopio. Esto permite que se formen imágenes en paralelo de numerosas cámaras. <Pabellón

Una ventaja de las cámaras descritas aquí es que las raíces laterales se fijan en su posición y se pueden visualizar usando lentes de inmersión de agua de alta resolución. La estabilidad espacial depende críticamente de la concentración de agar utilizada en la placa de agar de soporte. Inicialmente se ensayó una gama de concentraciones diferentes de agar 0,8% a agar 2%, lo que reveló que altas concentraciones en este rango fijaron raíces establemente en el espacio, pero el crecimiento de las raíces se ralentizó más rápido y algunas raíces mostraron signos de estrés mecánico, incluyendo el alargamiento celular reducido. Por el contrario, las concentraciones bajas de agar no proporcionaron el soporte requerido y las raíces derivaron en x, y, z durante la formación de imágenes. La losa óptima de agar de 1,5% fija la posición de la muestra sin efectos mecánicos adversos. En estas condiciones, después de asentarse en los primeros 30 min o así, las raíces son estables durante muchas horas, lo que permite la adquisición de datos durante la noche. Durante la adquisición de datos 4D, los rangos de pilas z eran típicamente bSe bloqueó por un adicional 5-10 μm, pero esto fue principalmente para acomodar el crecimiento fuera de plano de las raíces laterales en lugar de z-drift o bamboleo. Aunque la concentración estándar de agar proporciona cierta resistencia contra la penetración, las raíces gravitropicales crecientes penetrarán eventualmente en el agar. Sin embargo, a través de una modificación menor de la cámara de formación de imágenes, el crecimiento de las raíces podría mantenerse paralelo al cubreobjetos, permitiendo que las raíces laterales más antiguas y las raíces primarias sean imágenes. Además, la cámara de imagen básica podría ser fácilmente modificada para los hipocótilos. Los hipocótilos flotan más libremente en este sistema, por lo que el soporte del eje z para la adquisición de imágenes se incrementó normalmente hasta aproximadamente 20 μm. En este estudio, se utilizó un microscopio vertical, que permitió controlar las propiedades del sustrato. La cámara de formación de imágenes puede ser adaptable a configuraciones de microscopio invertido, pero la influencia dependiente del tiempo de la cubreobjetos rígida en los órganos interceptores tendrá que ser evaluada. </p>

Littlejohn y sus colegas han señalado que el PFD en sí mismo no disuelve fácilmente las moléculas biológicas, lo que significa que no se puede utilizar para el directamente para la entrega de compuestos farmacológicos [ 7] . Este problema se superó suministrando dichos compuestos a través de la losa de medio de crecimiento solidificado sobre el que descansa la placa de agar. Mientras que los sistemas de perfusión seguirán siendo el método de elección para experimentos de lavado, la cámara de formación de imágenes se ha utilizado con éxito para la administración de dexametasona 12 y otros compuestos. Una nota, mientras que este artículo estaba en preparación, von Wagenheim y colegas 18 describieron una cámara para el desarrollo de imágenes de la raíz lateral usando microscopía de lámina.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Prof. Geoffrey Wasteneys, de la Universidad de Columbia Británica, por la RFP-TUB6 que expresa semillas y un revisor anónimo por las correcciones útiles. Estamos agradecidos al Prof. Hugh Dickinson por alertarnos al uso de la película de celulosa como soporte mecánico ya John Baker para la fotografía. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación BBSRC BB / G013993 / 1 y BB / D004055 / 1 a IM, y un BBSRC Doctoral Training Award y Clarendon Scholarship a CK

Materials

Perfluorodecalin F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK FLUTEC PP6
Poly(dimethylsiloxane) gum  Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA Item # 132700 Carolina Observation Gel
Cavity Microscope Slides VWR International Ltd, Lutterworth, UK 10118-600 Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice
Cyanoacrylate glue Loctite 604753 Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice
Cellulosic cellophane membrane AA Packaging Limited, Preston, UK 325P cellulose film; 80mm disc
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References

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Kirchhelle, C., Moore, I. A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development. J. Vis. Exp. (123), e55331, doi:10.3791/55331 (2017).
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