المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر.
العديد من جوانب التنمية النباتية، مثل التشكل الجانبي الجذر، تحدث على فترات زمنية من عدة أيام. لدراسة العمليات الخلوية والخلايا الكامنة وراءها، مطلوب استراتيجيات عالية الدقة الفاصل الزمني الفاصل الزمني التي تحافظ على الظروف الفسيولوجية. يجب أن يكون للأنسجة النباتية ما يكفي من المغذيات وإمدادات المياه مع تبادل الغاز المستمر، ولكن عندما غمرت وتجمد تحت ساترة، فهي عرضة بشكل خاص لنقص الأكسجين. إحدى الاستراتيجيات التي تم توظيفها بنجاح هي استخدام نظام نضح للحفاظ على إمدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية. غير أن هذه الترتيبات يمكن أن تكون معقدة ومرهقة وتتطلب معدات متخصصة. يعرض هنا هو استراتيجية بديلة لنظام التصوير بسيط باستخدام بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. هذا النظام من السهل اقامة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، ويتم تركيبها بسهولة على مرحلة المجهر، والسماح لعدة غرف التصوير ليتم إعدادها وتصويرها في قدم المساواةعلال. في هذا النظام، لا يمكن تمييز معدلات نمو الجذر الجانبي عن معدلات النمو في ظل الظروف القياسية على لوحات أجار لليومين الأولين، ويستمر نمو الجذر الجانبي بمعدلات منخفضة ليوم آخر على الأقل. يتم توفير الأنسجة النباتية مع المواد الغذائية عن طريق لوح أجار التي يمكن استخدامها أيضا لإدارة مجموعة من المركبات الدوائية. تم إنشاء نظام لرصد التنمية الجذر الجانبي ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى صورة الأعضاء النباتية الأخرى مثل هيبوكوتيلز والجذور الأولية.
لدراسة العمليات الخلوية والخلايا التي تكمن وراء تطوير النباتات، وهناك طلب متزايد على استراتيجيات التصوير عالية الدقة على المدى الطويل عالية الدقة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في تجارب التصوير هذه في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التبادل الغازي الكافي بالإضافة إلى إمدادات المياه والمغذيات 1 و 2 و 3 . لاستخدام الأهداف مع فتحات العددية العالية للقرار البصري الأمثل، وينبغي وضع العينات في مكان قريب وموجهة بالتوازي مع ساترة. الحركة في x، y، و z الاتجاهات يجب أن يكون الحد الأدنى خلال التصوير.
في حين أن الشتلات غالبا ما يتم تركيبها في الماء أو محلول مائي للتصوير على المدى القصير، والماء لديه قدرة منخفضة لإذابة كو 2 و O 2 (1.54 ملغ / مل و 0.04 ملغ / مل، على التوالي عند 20 درجة مئوية، 0.1 ميجا باسكال) 4 ، مما يجعلفإنه غير مناسب لتجارب تمديد الوقت الفاصل. نظم الإرواء التي تحافظ على مستويات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية هي حل واحد لهذه المشكلة، وقد وضعت لكلا متحد البؤر المسح الضوئي بالليزر المجهري (كلسم) 1 ، 2 ، 3 والضوء ورقة المجهري (لسم) 5 . وقد صممت نظم مثل روتشيب 2 و روتاراي 3 خصيصا للتصوير الفاصل الزمني من الجذور النامية وتنطوي على بذور الإنبات في جهاز متعدد العينات بناء مخصص. هذه الترتيبات ضمان الحد الأدنى من الاضطرابات الميكانيكية ومصممة لتحليل مواز للشتلات متعددة، ولكن ليست الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية. وقد صممت كالدر وزملاؤه غرفة التصوير على أساس نضح أكثر تعقيدا الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية التي يقام العينة في موقف من قبل شبكةللسماح باستخدام العدسات التكبير الغمر عالية 1 .
عرض هنا هو بديل، حل بسيط لهذه المشكلة التي لا تقوم على نظم نضح، ولكن يستخدم بيرفلوروديكالين (بد)، وهو بيرفلوروكربون التي اكتسبت شعبية مؤخرا كوسيلة متزايدة ل أرابيدوبسيس التصوير 6 ، 7 ، 8 . في هذه التطبيقات، والقدرة العالية لل بد لذوبان كو 2 و O 2 (1.9 غ / مل ل O 2 في بد مقارنة 0.04 ملغ / مل في الماء) 9 ، ويسمح التبادل الغازي من قبل الأنسجة مغمورة. وعلاوة على ذلك، بد هو غير الفلورسنت ومؤشر الانكسار (1.313) هو مقارنة مع الماء (1.333) وأقرب إلى أن من السيتوسول (~ 1.4) من الهواء (1.000) 6 . وقد تم الإبلاغ عن المركبات البيرفلوروكربونية لديها الحد الأدنى من التأثير الفسيولوجي على مجموعة متنوعة من النباتات والنباتات رالقضايا 6 ، مع بذور الفجل تنبت بسهولة عندما تغمر في بد ويظهر النمو الطبيعي والتنمية لمدة يومين على الأقل كامل أيام عند تزويده بالماء 10 . وقد أجريت ملاحظات مماثلة لإنبات بذور الأرابيدوبسيس 6 . استنادا إلى تحفيز رامان نثر مباشرة صورة توزيع بد في الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس بعد تسلل، ويخلص ليتلجون وزملاؤه أن بد من المرجح لا تؤخذ من قبل الخلايا الحية 8 . وقد استخدم بد في الغالب إلى الأنسجة الجوية صورة، حيث أنه يزيد بشكل كبير عمق التصوير لأنها تتسرب بسهولة الفضاء الجوي بسبب التوتر السطحي المنخفض 6 . هنا، يتم اعتماد بد للتصوير مبائر على المدى الطويل من تطوير الجذور الجانبية. في هذا التكوين، يتم وضع شتلة واحدة أو أكثر على لوح من وسط النمو تتعزز مع أجار ومغمورة في بد. و بد يسمح gتبادل عاصي في غرفة التصوير، ومنع نقص الأكسجين. بد هو متقلب للغاية لذلك يتم الاحتفاظ بها من قبل طوقا من الصمغ بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) التي لديها أيضا عالية نفاذية الغاز (1.5 × 10 -12 بمول م -1 ق -1 با -1 ل كو 2 ) 11 . المغذيات والمياه يتم توفيرها من قبل بلاطة متوسطة صلابة مع أجار. في نفس الوقت، هذا أجار بلاطة يضغط بلطف الجذر ضد ساترة، وبالتالي تحديد موقفها النسبي في غرفة التصوير والسماح باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. وعلاوة على ذلك، لوح أجار يمكن استخدامها لإدارة مجموعة من العلاجات الدوائية، بما في ذلك ديكساميثازون، أوريزالين، وإيزوكسابين. يمكن تجميع غرف التصوير بأعداد كبيرة من الشرائح المجهرية القياسية باستخدام الحد الأدنى من المعدات. وقد وضعت غرف التصوير واتسمت لدراسة التنمية الجذر الجانبي ولكن قابلة للتكيف لتصوير أجهزة الشتلات الأخرى مثل نصائح الجذر الأولية وhypocotyls.
الطريقة المعروضة هنا هي استراتيجية بسيطة للتصوير مبائر عالية الدقة لتطوير الجذور الجانبية لمدة سنتين وتصل إلى ثلاثة أيام. لفترات تصل إلى 48 ساعة، لم يلاحظ أي آثار ضارة لنظام التصوير على تطوير الجذر الجانبي. بعد 48 ساعة، بدأ متوسط نمو الجذر الجانبي في التباطؤ، على الرغم من أن مجموعة فرعية كبيرة من الجذور (37٪) استمرت في النمو بمعدلات مماثلة لمتوسط نمو الجذور على الصفائح. لذلك، من خلال تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الجذور، الجذور التي تباطأ النمو بعد 48 ساعة يمكن استبعادها. لم يتم إجراء اختبارات منتظمة لغرف التصوير لفترات أطول من 72 ساعة، ولكن ينصح باستراتيجيات بديلة إذا كانت فترات التصوير الموسعة مطلوبة. يمكن ترك غرف التصوير على المسرح المجهر بشكل مستمر، إذا تم توفير الظروف البيئية المناسبة، أو إزالتها إلى منشأة النمو وعاد بشكل دوري إلى المجهر. هذا يسمح العديد من غرف ليتم تصويرها في موازاة. </ P>
ميزة واحدة من غرف وصفها هنا هو أن الجذور الجانبية ثابتة في موقفها ويمكن تصويرها باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. الاستقرار المكاني يعتمد بشكل حاسم على تركيز أجار المستخدمة في بلاطة أجار دعم. في البداية تم اختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من أجار 0.8٪ إلى 2٪ آجار، وكشف عن أن تركيزات عالية في هذا النطاق جذور ثابتة ثابتة في الفضاء، ولكن تباطؤ نمو الجذر بشكل أسرع وبعض الجذور عرضت علامات الإجهاد الميكانيكي، بما في ذلك انخفاض استطالة الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تركيزات أجار منخفضة لم توفر الدعم المطلوب وجذور انجرفت في x، y، z خلال التصوير. المثلى 1.5٪ أجار بلاطة يثبت موقف العينة دون آثار ميكانيكية ضارة. في ظل هذه الظروف، بعد تسوية في أول 30 دقيقة أو نحو ذلك، جذور مستقرة على مدى ساعات عديدة، مما يسمح الحصول على البيانات بين عشية وضحاها. أثناء الحصول على البيانات 4D، كانت نطاقات z- كومة عادة بمضرب من 5-10 ميكرون إضافية ولكن هذا كان أساسا لاستيعاب النمو خارج الطائرة من الجذور الجانبية بدلا من z– الانجراف أو تمايل. على الرغم من أن تركيز أجار القياسية يوفر بعض المقاومة ضد الاختراق، والجذور المتنامية غرافيتروبيكالي في نهاية المطاف تخترق أجار. ومع ذلك، من خلال تعديل طفيف من غرفة التصوير، ويمكن الحفاظ على نمو الجذر موازية ساترة، مما يسمح للجذور الجانبية القديمة والجذور الأولية لتكون تصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكون مخصصة غرفة التصوير الأساسية ل هيبوكوتيلز. هيبوكوتيلز هي أكثر بحرية العائمة في هذا النظام بحيث تم زيادة قوس Z- محور للحصول على صورة عادة إلى حوالي 20 ميكرون. في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر تستقيم في جميع أنحاء، مما يسمح للخصائص الركيزة ليتم السيطرة عليها. غرفة التصوير قد تكون قابلة للتكيف مع تكوينات المجهر مقلوب ولكن التأثير على الوقت من ساترة جامدة على اعتراض الأجهزة تحتاج إلى تقييم. </p>
وقد أشار ليتلجوهن وزملاؤه إلى أن بد نفسها لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم المركبات الدوائية 7 . تم التغلب على هذه المشكلة عن طريق توريد مثل هذه المركبات من خلال بلاطة من وسط النمو المعزز الذي يقع على لوح أجار. في حين أن نظم نضح ستبقى الطريقة المفضلة للتجارب غسل التدريجي، وقد استخدمت غرفة التصوير بنجاح لإدارة ديكساميثازون 12 والمركبات الأخرى. ملاحظة واحدة، في حين أن هذه المادة في التحضير فون واجنهيم وزملاؤه 18 وصفت غرفة للتصوير تطوير الجذر الجانبي باستخدام ورقة الضوء المجهري.
The authors have nothing to disclose.
نشكر البروفيسور جيفري واستينيس، جامعة كولومبيا البريطانية، للتعبير عن البذور رفب-TUB6 ومراجع مجهول للحصول على تصحيحات مفيدة. ونحن ممتنون للبروفيسور هيو ديكنسون لتنبيهنا إلى استخدام فيلم السليلوز كدعم ميكانيكي وجون بيكر للتصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل بمنح البحوث ببسك / بب / G013993 / 1 و بب / D004055 / 1 إلى إم، وجائزة تدريب الدكتوراه ببسرك ومنحة كلارندون إلى سك
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |