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Developmental Biology

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Published: May 17, 2017
doi:
10.3791/55331
,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford

Summary

Hier präsentiert sich eine einfache Technik für hochauflösende konfokale Zeitraffer-Bildgebung der Wurzel- und Hypokotyl-Entwicklung für bis zu 3 Tage mit hohen Ziffernblende und Perfluordecalin als Immersionsmedium.

Abstract

Mehrere Aspekte der Pflanzenentwicklung, wie die laterale Wurzelmorphogenese, treten auf Zeitspannen von mehreren Tagen auf. Um zugrunde liegende zelluläre und subzelluläre Prozesse zu untersuchen, sind hochauflösende Zeitraffer-Mikroskopie-Strategien erforderlich, die physiologische Zustände bewahren. Pflanzentücher müssen eine ausreichende Nährstoff- und Wasserversorgung mit anhaltendem gasförmigem Austausch haben, aber wenn sie unter einem Deckglas untergetaucht und immobilisiert sind, sind sie besonders anfällig für Anoxie. Eine Strategie, die erfolgreich eingesetzt wurde, ist die Verwendung eines Perfusionssystems, um eine konstante Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen aufrechtzuerhalten. Solche Anordnungen können jedoch kompliziert, umständlich sein und eine spezielle Ausrüstung erfordern. Präsentiert hier ist eine alternative Strategie für ein einfaches Bildgebungssystem mit Perfluordecalin als Immersionsmedium. Dieses System ist einfach einzurichten, erfordert minimales Equipment und lässt sich problemlos auf einer Mikroskopstufe montieren, so dass mehrere Abbildungskammern aufgestellt und abgebildet werden könnenAllel. In diesem System sind die lateralen Wurzelwachstumsraten von den Wachstumsraten unter Standardbedingungen auf Agarplatten für die ersten beiden Tage nicht zu unterscheiden, und das laterale Wurzelwachstum setzt sich für mindestens einen anderen Tag mit reduzierten Raten fort. Pflanzengewebe werden mit Nährstoffen über eine Agarplatte versorgt, die auch zur Verabreichung einer Reihe von pharmakologischen Verbindungen verwendet werden kann. Das System wurde eingerichtet, um die laterale Wurzelentwicklung zu überwachen, ist aber leicht an Bild anderer Pflanzenorgane wie Hypokotylen und Primärwurzeln anpassbar.

Introduction

Um zelluläre und subzelluläre Prozesse zu untersuchen, die der Pflanzenentwicklung zugrunde liegen, gibt es eine steigende Nachfrage nach hochauflösenden Langzeit-Zeitraffer-Imaging-Strategien. Eine wesentliche Herausforderung bei solchen bildgebenden Experimenten ist die Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen einschließlich des ausreichenden gasförmigen Austausches sowie der Zufuhr von Wasser und Nährstoffen 1 , 2 , 3 . Um Ziele mit hohen numerischen Aperturen für eine optimale optische Auflösung zu nutzen, sollten die Proben in unmittelbarer Nähe positioniert und parallel zum Deckglas ausgerichtet sein. Die Bewegung in x-, y- und z-Richtung sollte idealerweise während der Bildgebung minimal sein.

Während Sämlinge häufig in Wasser oder wässriger Lösung zur kurzzeitigen Bildgebung eingebaut werden, hat Wasser eine geringe Kapazität zum Auflösen von CO 2 und O 2 (1,54 mg / ml und 0,04 mg / ml bei 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , was machtEs ist ungeeignet für längere Zeitraffer-Experimente. Perfusionssysteme, die konstante Sauerstoff- und Nährstoffmengen beibehalten, sind eine Lösung für dieses Problem und wurden sowohl für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) 1 , 2 , 3 als auch für die Lichtbogenmikroskopie (LSM) 5 entwickelt. Systeme wie die RootChip 2 und die RootArray 3 wurden speziell für die Zeitraffer-Bildgebung entwickelt, um Wurzeln zu entwickeln und die Keimung von Samen in einem kundenspezifischen Mehrfachprobengerät einzubeziehen. Diese Anordnungen sorgen für eine minimale mechanische Störung und sind für die parallele Analyse mehrerer Sämlinge ausgelegt, aber nicht für die Bildgebung von subzellulären Strukturen optimiert. Calder und Kollegen haben eine kompliziertere Perfusions-basierte Abbildungskammer entworfen, die für die Abbildung von subzellulären Strukturen optimiert ist, in denen die Probe durch ein Netz in Position gehalten wirdUm die Verwendung von Hochdruck-Immersionslinsen 1 zu ermöglichen.

Hier ist eine alternative, einfache Lösung für dieses Problem, die nicht auf Perfusionssystemen basiert, sondern verwendet Perfluordecalin (PFD), ein Perfluorkohlenstoff, der in jüngster Zeit als Montagemedium für die Arabidopsis-Bildgebung 6 , 7 , 8 gewonnen hat . In solchen Anwendungen ermöglicht die hohe Kapazität von PFD zum Auflösen von CO 2 und O 2 (1,9 g / ml für O 2 in PFD im Vergleich zu 0,04 mg / ml in Wasser) 9 einen gasförmigen Austausch durch das eingetauchte Gewebe. Darüber hinaus ist PFD nicht fluoreszierend und sein Brechungsindex (1.313) ist vergleichbar mit dem von Wasser (1.333) und ist näher an der von Cytosol (~ 1,4) als Luft (1.000) 6 . Es wurde berichtet, dass Perfluorkohlenstoffe eine minimale physiologische Wirkung auf eine Vielzahl von Pflanzen und Pflanzen habenProbleme 6 , mit Rettich Samen keimt leicht, wenn in PFD eingetaucht und zeigt normales Wachstum und Entwicklung für mindestens zwei volle Tage, wenn mit Wasser 10 geliefert. Ähnliche Beobachtungen wurden für die Keimung von Arabidopsis- Samen gemacht 6 . Basierend auf stimulierter Raman-Streuung, um die Verteilung von PFD in Arabidopsis-Blattgeweben nach der Infiltration direkt abzubilden, schließen Littlejohn und Kollegen, dass PFD wahrscheinlich nicht von lebenden Zellen aufgenommen wird 8 . PFD wurde bisher überwiegend zum Aufnehmen von Luftgeweben eingesetzt, wo es die Bildtiefe deutlich erhöht, da es aufgrund seiner geringen Oberflächenspannung leicht Lufträume infiltriert. Hier wird PFD für die langfristige konfokale Bildgebung der Entwicklung von Seitenwurzeln angenommen. In dieser Konfiguration werden ein oder mehrere Sämlinge auf eine mit Agar verfestigte und in PFD eingetauchte Bramme von Wachstumsmedium platziert. Die PFD erlaubt gAseous Austausch in der Abbildungskammer, verhindert Anoxie. PFD ist sehr flüchtig, so dass es durch eine Dichtung von Poly (dimethylsiloxan) -Gummi, die auch eine hohe Gaspermeabilität (1,5 x 10 & supmin ; ¹ & supmin ; ¹ & supmin ; ¹ & supmin ; ¹ & supmin ; ¹ Pa & supmin ; ¹ für CO & sub2 ; ) 11 , beibehalten hat. Nährstoffe und Wasser werden von der Bramme von Medium mit Agar verfestigt geliefert. Gleichzeitig drückt diese Agarplatte sanft die Wurzel gegen das Deckglas, wodurch sie ihre relative Position in der Abbildungskammer fixiert und die Verwendung von hochauflösenden Wassereintauchlinsen ermöglicht. Darüber hinaus kann die Agarplatte verwendet werden, um eine Reihe von pharmakologischen Behandlungen, einschließlich Dexamethason, Oryzalin und Isoxaben zu verabreichen. Die Abbildungskammern können in großen Stückzahlen aus Standard-Mikroskopie-Folien mit minimaler Ausrüstung zusammengebaut werden. Die Abbildungskammern wurden entwickelt und charakterisiert, um die laterale Wurzelentwicklung zu untersuchen, aber sie sind anpassungsfähig für die Bildgebung anderer Sämlingsorgane wie primäre Wurzelspitzen undHypocotyls

Protocol

1. Erstellen der Kammer Mit einem Glasschneider 3 mm breite Streifen vom Ende eines 1 mm dicken Mikroskopschiebers schneiden. Mit einem Cyanacrylat-Super-Leim oder einem doppelseitigen Klebeband kleben diese Glasstreifen etwa 45 mm über die Breite eines zweiten Objektträgers (Abbildung 1A ). Ein Schieber pro Kammer ist erforderlich, plus zusätzliche Schieber zum Gießen von Agarplatten (eine Folie ergibt 2-3 Agarplatten). Folien können wiederverwendet werden. Zwischen den Glasstreifen, Art und Weise eine Dichtung von identischer Höhe aus gasdurchlässigem Poly (dimethylsiloxan) Gummi. Legen Sie eine Kugel aus Poly (dimethylsiloxan) -Gummi auf den Objektträger (Abbildung 1B ), benetzen Sie einen zweiten Objektträger mit einer kleinen Menge von 100% absolutem Ethanol und glätten Sie die Poly (dimethylsiloxan) -Gummi-Kugel mit der zweiten Folie, bis sie die Höhe erreicht hat Der Glasstreifen ( Abbildung 1C ). Wenn nötig, schneiden Sie überschüssiges Poly (dimeThylsiloxan) -Gummi mit einer Rasierklinge und wiederholte Abflachung. Mit einem geeigneten, in absolutem Ethanol benetzten Cutter oder Rasierklinge den inneren Teil des Poly (dimethylsiloxan) -Gummis entfernen, um den Hohlraum zu erzeugen, der später die Sämlings- und Agarplatte ( Abb. 1D ) hält. Das Gel mit einer Rasierklinge sorgfältig abschneiden, um eine Dichtung mit einer Endwanddicke von ca. 2 mm zu schaffen ( Bild 1E ). Die Permeabilität von Gasen durch eine Poly (dimethylsilaxan) Barriere ist unabhängig von Dicken über 50 μm 11 . 2. Erstellen der Agar-verfestigten Bramme des Wachstumsmediums Auf einer Mikroskopie-Folie mit zwei Glasstreifen legen Sie ein Deckglas (22 mm x 50 mm) so auf, dass es auf beiden Glasstreifen aufliegt. Pipette geschmolzenes halbfestes Murashige- und Skoog-Wachstumsmedium mit 1% w / v Saccharose und 1,5% w / v Agar (½ MS) in den resultierenden RaumUnterhalb des Deckglases, bis dieser vollständig gefüllt ist (ca. 1 mL Gesamtvolumen) und verlassen, bis Agar eingestellt ist (ca. 5 min). Anmerkung: Pharmakologische Verbindungen können durch die Agarplatte verabreicht werden, indem dem flüssigen Medium geeignete Konzentrationen zugesetzt werden, bevor die Bramme gegossen wird. Dies wurde erfolgreich auf Dexamethason 12 , Isoxaben, 2,6-Dichlorbenzonitril (DCB), Oryzalin und Latrunculin B getestet. 3 Beenden des Kammeraufbaus Luft zerlegen PFD durch Schütteln eines kleinen Volumens von PFD in einem Rohr 7 . Fügen Sie eine kleine Menge (ca. 200 μl) Luft-äquilibrierte PFD in die Vertiefung der Gel-Dichtung, aber füllen Sie nicht die Kammer vollständig. Diese PFD wird dazu beitragen, das Fallen von Luftblasen unter der Agarplatte zu vermeiden, wie es in die Kammer gelegt wird. Entfernen Sie das Deckglas von der Agarplatte (in Schritt 2.2 oben) und verwenden Sie eine Rasierklinge, um einen Teil von abzuschneidenGröße und Form. Dann legen Sie es in die Vertiefung der Geldichtung ( Abbildung 1F ). Es sollte eine Lücke von 2-4 mm zur Dichtung herum sein. Füllen Sie die Kammer vollständig mit Luft-äquilibrierten PFD. Legen Sie eine oder mehrere A. thaliana Sämlinge (bis zu 3 Sämlinge für die Bildgebung über 2-3 Tage) auf die Agarplatte mit den Cotyledonen und Hypokotyl hängen über den Rand, schwimmend in PFD (Abbildung 1G ). Um Sämlinge zu erhalten, sterilisieren Samen mit 70% Ethanol, pflanzen auf ½ MS-Medium, ergänzt mit 1% Saccharose und 0,8% Agar, für 2-4 Tage bei 4 ° C stratifizieren und auf vertikal orientierten Platten bei 22 ° C in einem 16 wachsen H Licht / 8 h dunkles Regime. Für die Bildgebung von Seitenwurzeln, wachsen Pflanzen für 7-10 Tage vor der Übertragung auf Bildkammern. Um die Kammer zu schließen, legen Sie ein Deckglas an, das auf die Optik des Objektivs abgestimmt ist. Drücken Sie es vorsichtig mit dem Rand eines Glasmikroskop-Objektträgers bis zum Deckglas nach untenRuht auf beiden Glasstreifen ( Bild 1H ). Sichern Sie das Deckglas mit Streifen von 1,25 cm breiten Mikroporen-Chirurgie-Band, das halb-lose an jedem Ende geschnitten wird, wenn gewünscht (Abbildung 1I ). Lassen Sie die Probe ca. 30 Minuten vor der Bildgebung absetzen. Dies minimiert die Probenbewegung während der Bildgebung. Führen Sie die Abbildung mit einem aufrechten Mikroskop durch, um ein kontrolliertes Substrat für das Wachstum aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie 20X / 0.7NA oder 63X / 1.2NA CS2 Ziele.

Representative Results

Seitliche Wurzeln wachsen in physiologischen Raten in Bildgebungskammern. Die lateralen Wurzellängen der Pflanzen in den Abbildungskammern wurden in stündlichen Intervallen gemessen (Abbildung 2A , links, Film 1, n = 23) und die Wachstumsraten wurden mit denen von Seitenwurzeln verglichen, die auf Standard-Petri-Platten mit demselben Agar-verfestigten Medium aufgewachsen waren ( Abb 2A , rechts, Film 2, n = 23). Die Wachstumsraten können zwischen den Seitenwurzeln beträchtlich variieren, wobei die Länge der Wurzel aufgrund der zunehmend längeren Zonen des Wachstums und der Proliferation ein entscheidender Faktor ist. Daher wurden Sätze von Seitenwurzeln ausgewählt, um Wurzeln unterschiedlicher Anfangslängen (im Bereich von 50 μm bis 1150 μm) sowohl in der Abbildungskammer als auch in der Agarplatte darzustellen. Durchschnittliche laterale Wurzellänge zu Beginn des ExperimentsWar in jedem Satz ähnlich (439 und 442 μm für Abbildungskammern und Platten). Im analysierten Zeitintervall von 27 h war das laterale Wurzelwachstum sowohl in Abbildungskammern als auch auf Platten mit einer mittleren Wachstumsrate von 52 μm / h (R 2 = 0,997) auf Platten und 51 μm / h in Abbildungskammern annähernd linear ( R & sub2 ; = 0,993) ( Fig. 2B ). Wachstumsraten einzelner Seitenwurzeln, die sowohl auf Platten als auch in Abbildungskammern ( Fig. 2C ) sehr variabel sind und von 17 μm / h bis 82 μm / h in Abbildungskammern und von 13 μm / h bis 87 μm / h auf Platten liegen. Während die Wachstumsraten im Allgemeinen mit der Länge der Wurzel zunahmen, variierten die Wachstumsraten immer noch wesentlich zwischen den Wurzeln ähnlicher Länge, aber die Varianz war in den Abbildungskammern und auf den Platten ähnlich. Seitliche Wurzeln vermehren sich in bildgebenden Kammern und können mit hi abgebildet werdenGh numerical-aperture Ziele. Seitwärtswurzeln, die den Plasmamembranmarker NPSN12-YFP 14 und den Mikrotubuli-Marker UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 exprimieren, wurden in 1-stündigen Intervallen abgebildet, um das Mikrotubulusverhalten während der Zellproliferation in bildgebenden Kammern zu dokumentieren ( Abbildung 2D , Film 3). In diesen Kammern waren die Seitenwurzeln in ihrer Position auf den x-, y- und z-Achsen sehr stabil, was die Erfassung von kontinuierlichen zeitraffer konfokalen Stapeln über mehrere Stunden ermöglicht. Meristematische Zellen vermehrten sich kontinuierlich, wie aus der Bildung von Präprophasenbanden (Abbildung 2D , grüne Pfeile), mitotischen Spindeln (Abbildung 2D , weiße Pfeile) und Phragmoplasten (Abbildung 2D , blaue Pfeile) hervorgeht. Wie bei Sämlingen auf Petrischalen,Vollständig verlängerte Wurzelzellen in bildgebenden Kammern initiierten Wurzelhaare ( Fig. 2A , Fig. 2D , Pfeilköpfe), was ferner anzeigt, daß die Entwicklung in den Abbildungskammern erwartungsgemäß fortschreitet. Um ein breites Sichtfeld zu liefern, wurden die Bilder in Fig. 2D mit einem 20x / 0,7 NA-Objektiv erhalten. Es war auch möglich, hochauflösende Bilder von Seitenwurzeln zu erhalten, wobei ein Wasser-Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur 63x / 1,2 NA ( Fig. 2E ) verwendet wurde. Das seitliche Wurzelwachstum wird in Bildungskammern für bis zu drei Tage gehalten. Um zu erforschen, wie lange Abbildungskammern das laterale Wurzelwachstum bei physiologischen Raten unterstützen konnten, wurde die laterale Wurzellänge in den Abbildungskammern (n = 27) und auf den Platten (n = 33) bei 0 h, 24 h, 48 h und 72 h quantifiziert. Die Wurzeln choSen waren kürzer als 200 μm bei 0 h, mit einer durchschnittlichen lateralen Wurzellänge von 117 μm in bildgebenden Kammern und 121 μm auf Platten. Da kürzere Wurzeln im Durchschnitt langsamer wachsen ( Abb. 2C ), wuchsen sie weniger oft über den Rand der Agarplatte und waren leichter zu bildlich. Das durchschnittliche Wachstum aller Seitenwurzeln war in den Bildgebungskammern im Vergleich zu Petri-Platten in den ersten 48 h nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 3A ). Allerdings wurde das durchschnittliche Wachstum zwischen 48 h und 72 h deutlich reduziert (Abbildung 3A ). Während sich die Wachstumsraten nach 48 h in den Bildgebungskammern allgemein verlangsamen, bleiben die Wachstumsraten zwischen den Individuen sehr variabel (Abbildung 3B , 3C ), was bedeutet, dass es eine wesentliche Teilmenge von Seitenwurzeln gibt, die mit vergleichbaren Raten auf Platten und in Kammern wächst Über die gesamte Wachstumsphase von 72 h. 23 der 33 seitlichen Wurzeln angebautAuf Platten (69,7%) erreichen eine Länge innerhalb einer Standardabweichung der mittleren Länge bei 72 h (zwischen 927 und 3,163 μm, Abbildung 3B , rot). 10 von 27 (37,0%) Seitenwurzeln in Abbildungskammern erreichen innerhalb dieses Intervalls eine Länge ( Abbildung 3B , rot). Imaging-Kammern lassen sich leicht an ältere Seitenwurzeln, Primärwurzeln und Hypokotylen anpassen . Eine der Beschränkungen des ursprünglichen Bildgebungsentwurfs war, dass, während die steife Agarplatte eine gewisse mechanische Beständigkeit lieferte, gravitropisch wachsende Wurzeln schließlich die Agarplatte durchdrang, was zu einem Verlust der Bildqualität ( 4B ) und einem Wachstum über den Arbeitsabstand von hoher NA hinaus führte Linsen, auch der relativ lange Arbeitsabstand (0,3 mm) 63X / 1.3 NA CS2 Ziel. Junge Seitenwurzeln fehlen dem Statolith enthaltendenColumella-Zellen, die für den Gravitropismus 17 benötigt wurden, so dass sie zunächst parallel zum Deckglas in Abbildungskammern wuchsen (Abbildung 2E ). Wenn sie länger werden und Columellen und Statolithen bilden, zeigen die Seitenwurzeln einen zunehmenden positiven Gravitropismus, während die primären Wurzeln eine starke gravitropische Antwort von der Keimung an zeigen. Dies beschränkt auf ein paar Stunden die Periode, über die primäre Wurzeln abgebildet werden können, und es begrenzt stark die Anfangslänge der seitlichen Wurzeln, die kontinuierlich für 48 h oder mehr abgebildet werden können. Um diese Begrenzung zu überwinden, wurde die Kammer so modifiziert, dass das Wachstum parallel zu dem Deckglas durch eine Cellulose-Zellophan-Membran gehalten wird, die als Penetrationsbarriere auf der Oberfläche der Agarplatte wirkt ( 4A ). Erste Versuche, die eine 1,5% -ige Agarplatte verwenden, verursachten ein verringertes Wurzelwachstum innerhalb der ersten 24 h, was möglicherweise auf mechanischen Stress zurückzuführen war. Niedrigere Agar-Konzentrationen in der Platte wurden getestetEs wurde festgestellt, dass in den Kammern mit einer Platte, die 0,8% Agar und Cellulosefolie enthielt, die jungen Seitenwurzelwachstumsraten in den konventionellen Kammern für die ersten 48 h nicht signifikant von den Wachstumsraten abweichen. Für 0-24 h betrug das mittlere Wurzelwachstum in Cellularkammern und konventionellen Kammern 242 μm bzw. 262 μm (p = 0,78 Student's t-Test) und für 24-48 h betrug 330 μm bzw. 355 μm 1 (p = 0,67 Student's T-Test); N = 12 und n = 11. Diese Anordnung verhinderte effektiv, dass sich die Seitenwurzeln von dem Deckglas weg in den Agar wachsen ließen und auch die Bildgebung der Primärwurzeln bis zu 48 h erlaubten (Abbildung 4C ). Um zu testen, ob die Abbildungskammern für andere Organe als Wurzeln angepasst werden könnten, wurden Arabidopsis- Hypokotyle ausgewählt. Hypocotyle sind wesentlich dicker als die Wurzeln, so dass in der herkömmlichen Abbildungskammer die oberste cElls wurden gegen das Deckglas gedrückt, was zu Verformungen führte. Ein alternatives Design wurde daher mit Hohlraumschiebern entwickelt, die eine ovale Depression in ihrer Mitte enthalten (Abbildung 4D ). In dieser Konfiguration wurde eine 1 mm dicke Bramme aus Agar (hergestellt wie in 2.2 oben) mit einem Ende, das um wenige mm in den Gleithohlraum vorspringt ( Fig. 4D ), positioniert. Hypocotyle wurden oberhalb des Hohlraums in der Folie positioniert, während die Wurzel über dem horizontalen Teil positioniert war. Dies stellte sicher, dass der Sämling im Raum von der Wurzel fixiert wurde, aber das Hypokotyl wurde nicht zerquetscht. Während die Wachstumsraten in den Kammern im Vergleich zu den Platten nicht systematisch quantifiziert wurden, zeigten die Hypokotyle in den Abbildungskammern die gut beschriebene Welle des Längswachstums, die das Hypokotyl wanderte (Abbildung 4E , 4F ) 16 . <img alt="Abbildung 1"Class = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Zusammenbau einer Abbildungskammer. Alle Details sind im Text beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2 : Seitliche Wurzeln wachsen unter physiologischen Bedingungen in bildgebenden Kammern. ( A ) Arabidopsis laterale Wurzelentwicklung in einer Abbildungskammer (links) und auf einer Platte (rechts) über 25 h (konstantes Licht, horizontale Inkubation, gleichzeitige Bildgebung). Maßstäbe = 200 μm ( B ) Plot mit lateralen Wurzellängen über 27 h (gemessen in 1 h Intervallen), von Seitenwurzeln wie in ( A ) gezeigt. IndividuellUal Wurzeln in grau aufgetragen (n = 23 für Platten und Bildgebungsräume), mittlere Länge als rote Kreise. Fehlerbalken = 1 SD. Rote Linie ist lineare Passung durch durchschnittliche Längen. ( C ) Plot, der die durchschnittliche Wachstumsrate für alle in ( B ) dargestellten Seitenwurzeln relativ zu ihrer Anfangslänge zeigt. ( D ) Maximale Intensitätsprojektionen von 3D konfokalen Stapeln, die von Seitenwurzeln gewonnen wurden, die NPSN12-YFP und RFP-TUB6 zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten ausdrücken. Inset: Vergrößerung der Box-Region. Grüne Pfeile: Preprophase Bands; Weiße Pfeile: mitotische Spindeln; Blaue pfeile: phragmoplasten; Pfeilspitzen: Wurzelhaare. ( E ) Maximale Intensitätsprojektionen von hochauflösenden Bildern, die von einer jungen Seitenwurzel der in ( D ) gezeigten transgenen Linie unter Verwendung eines 63X / 1,2 NA-Ziels und einer Nyquist-Abtastung (Pixelabmessungen 77 nm x 77 nm) bei 0 h und 16 erhalten wurden H; Sternchen lokalisieren identische Zellen zu jedem Zeitpunkt; Pfeil zeigt eine Zelle an, die zwischen 0h und 16 h teilt.Maßstäbe = 50 μm (AC); 20 μm (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3 : Langfristige laterale Wurzelentwicklung in Bildgebungskammern. ( A ) Plot mit durchschnittlichem absoluten Wurzelwachstum in drei aufeinanderfolgenden 24-Stunden-Intervallen in Abbildungskammern im Vergleich zu Platten. Ns zeigt p> 0,05 an; *** gibt p <0,001 (Schüler-t-Test) an. N = 33 (Platten) und n = 27 (Abbildungskammern). ( B ) Plot, der seitliche Wurzellängen zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten auf allen in (A) verwendeten Wurzeln zeigt. Rot: alle Seitenwurzeln mit einer Endlänge innerhalb von 1 SD des Mittelwerts aller Seitenwurzeln, die auf Platten (zwischen 927 und 3163 μm) gewachsen sind. ( C ) Maximal inTensionsprojektionen repräsentativer 3D konfokaler Stapel des Plasmamembranmarkers NPSN12-YFP in Seitenwurzeln, die zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten über 72 h erworben wurden. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4 : Abbildungskammern können für andere Pflanzenorgane angepasst werden. ( A – C ) Bildgebungskammeranpassung für Primärwurzeln. ( A ) Schema der bildgebenden Kammergestaltung. Dies ist identisch mit der Standardausführung (Abbildung 1 ) abgesehen von zwei Modifikationen: Die MS-Medium-Platte enthält 0,8% Agar anstelle von 1,5% Agar und ein Cellulosefilm (rot) wird zwischen Agar und Pflanze platziert, um das Wachstum zu verhindernIn den agar ( B ) XY (oben) und XZ (untere) Maximalintensitätsprojektionen repräsentativer 3D konfokaler Stapel des Plasmamembranmarkers NPSN12-YFP in der Primärwurzel eines 7 Tage alten Sämlings, der bei 0 h und 48 h bei einer herkömmlichen Bildgebung abgebildet wurde Kammer. Beachten Sie, dass die Wurzel aufgrund der gravitropischen Reaktion in den Agar wächst. ( C ) XY (oben) und XZ (untere) Maximalintensitätsprojektionen repräsentativer 3D konfokaler Stapel des Plasmamembranmarkers NPSN12-YFP in der Primärwurzel eines sieben Tage alten Sämlings, der bei 0 h und 48 h bei der Bildgebung abgebildet wurde Kammer mit Cellulosefolie. Vor der Applikation wurde der Cellulosefilm in 80% Ethanol sterilisiert und in flüssigem ½ MS-Medium eingeweicht. Man beachte, dass das gravitropische Wachstum der Wurzel in den Agar verhindert wird. ( D – F ) Imaging – Kammeranpassung für Hypokotyle. ( D ) Schematische Darstellung der Darstellung der Hypokotylbildgebung. Eine Poly (dimethylsiloxan) -Gummi-Dichtung (grau) wird hergestelltRot auf einem Hohlraum zwischen zwei Glasstreifen (gelb). Eine Platte von 1,5% Agar gleichmäßiger Dicke (beige) wird auf den Schieber gelegt, der teilweise in den Hohlraum reicht. Die Kammer ist mit PFD (blau) gefüllt. Sämlinge werden auf die Agarplatte gelegt, so dass das Hypokotyl den abwärts geneigten Bereich der Agarplatte in dem Hohlraum einnimmt, während die Wurzel den horizontalen Teil des Agars positioniert ist. Die Kammer ist mit einem Deckglas verschlossen. ( E ) Maximale Intensitätsprojektionen repräsentativer 3D konfokaler Stapel des Plasmamembranmarkers NPSN12-YFP in einem Hypokotyl eines zweitägigen alten Sämlings, der über 48 h zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten abgebildet wurde. ( F ) Längswachstum in zwei aufeinanderfolgenden Zeitintervallen einzelner Zellen entlang der basalen zur apikalen Achse (relative Positionen bei 0 h entlang der in E gezeigten Achse) des in ( E ) gezeigten Hypokotyls. Beachten Sie die zuvor beschriebene Wachstumswelle, die das Hypokotyl 16 migriert. Maßstäbe = 100 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Film 1: Bitte hier klicken um diesen Film herunterzuladen. Film 2: Bitte hier klicken um diesen Film herunterzuladen. Film 3: Bitte cLecken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Discussion

Die hier vorgestellte Methode ist eine einfache Strategie für hochauflösende konfokale Bildgebung der Entwicklung von Seitenwurzeln für zwei und bis zu drei Tage. Für Perioden bis zu 48 h wurden keine nachteiligen Wirkungen des bildgebenden Systems auf die laterale Wurzelentwicklung beobachtet. Nach 48 h begann das durchschnittliche laterale Wurzelwachstum zu verlangsamen, obwohl eine wesentliche Teilmenge der Wurzeln (37%) weiterhin mit Raten wuchs, die mit dem durchschnittlichen Wurzelwachstum auf Platten vergleichbar waren. Durch die Abbildung einer ausreichend großen Anzahl von Wurzeln können daher Wurzeln, deren Wachstum nach 48 h verlangsamt, ausgeschlossen werden. Systematische Tests der Bildgebungskammern wurden nicht länger als 72 Stunden durchgeführt, sondern es werden auch alternative Strategien empfohlen, wenn erweiterte Bildgebungszeiten gewünscht werden. Bildaufnahmungskammern können kontinuierlich auf dem Mikroskopstadium belassen werden, wenn geeignete Umgebungsbedingungen vorgesehen sind oder zu einer Wachstumseinrichtung entfernt und periodisch zum Mikroskop zurückgeführt werden. Dadurch können zahlreiche Kammern parallel abgebildet werden. </ P>

Ein Vorteil der hier beschriebenen Kammern ist, dass seitliche Wurzeln in ihrer Position fixiert und mit hochauflösenden Wassereindringlinsen abgebildet werden können. Die räumliche Stabilität hängt entscheidend von der Agar-Konzentration ab, die in der unterstützenden Agarplatte verwendet wird. Anfänglich wurde eine Reihe von Konzentrationen von 0,8% Agar bis 2% Agar getestet, was zeigt, dass hohe Konzentrationen in diesem Bereich stabil Wurzeln im Raum fixierten, aber das Wurzelwachstum verlangsamte sich schneller und einige Wurzeln zeigten Anzeichen einer mechanischen Belastung, einschließlich reduzierter Zelldehnung. Im Gegensatz dazu lieferten niedrige Agar-Konzentrationen nicht die erforderliche Unterstützung und Wurzeln, die während der Bildgebung in x, y und z getrieben wurden. Die optimale 1,5% Agarplatte fixiert die Position der Probe ohne nachteilige mechanische Effekte. Unter diesen Bedingungen, nach dem Absetzen in den ersten 30 min oder so, Wurzeln sind über viele Stunden stabil, so dass über Nacht Datenerfassung ermöglicht. Während der Erfassung von 4D-Daten waren z-Stack-Bereiche typischerweise bVon einem zusätzlichen 5-10 um gestapelt, aber das war vor allem, um das außerschichtliche Wachstum der Seitenwurzeln anstatt von z-Drift oder Wackeln aufzunehmen. Obwohl die Standard-Agar-Konzentration einen gewissen Widerstand gegen die Penetration bietet, werden gravitropisch wachsende Wurzeln schließlich in den Agar eindringen. Jedoch konnte durch eine geringfügige Modifikation der Abbildungskammer das Wurzelwachstum parallel zum Deckglas gehalten werden, was es ermöglicht, dass ältere Seitenwurzeln und Primärwurzeln abgebildet werden können. Darüber hinaus könnte die Grundbildkammer leicht für Hypokotyle angepasst werden. Hypocotyle sind in diesem System frei schwimmend, so dass die z-Achsenhalterung für die Bildaufnahme gewöhnlich auf etwa 20 μm erhöht wurde. In dieser Studie wurde ein aufrechtes Mikroskop überall verwendet, wodurch die Substrat-Eigenschaften kontrolliert werden konnten. Die Abbildungskammer kann an invertierte Mikroskopkonfigurationen angepasst werden, aber der zeitabhängige Einfluss des starren Deckglases auf abfangende Organe muss ausgewertet werden. </pAufrechtzuerhalten

Littlejohn und Kollegen haben darauf hingewiesen, dass PFD selbst nicht leicht biologische Moleküle auflöst, was bedeutet, dass es nicht direkt für die Lieferung von pharmakologischen Verbindungen verwendet werden kann 7 . Dieses Problem wurde durch die Zuführung solcher Verbindungen durch die Platte des verfestigten Wachstumsmediums, auf der die Agarplatte ruht, überwunden. Während Perfusionssysteme die Methode der Wahl für Auswaschversuche bleiben, wurde die Abbildungskammer erfolgreich für die Verabreichung von Dexamethason 12 und anderen Verbindungen verwendet. Ein Hinweis, während dieser Artikel in Vorbereitung von Wagenheim war und die Kollegen 18 eine Kammer zur Abbildung der lateralen Wurzelentwicklung mit Lichtbogenmikroskopie beschrieben haben.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, für den Samen-Ausdruck von RFP-TUB6 und einem anonymen Gutachter für hilfreiche Korrekturen. Wir bedanken uns bei Prof. Hugh Dickinson dafür, dass wir uns für den Einsatz von Cellulosefolie als mechanische Unterstützung und John Baker für die Fotografie bedanken. Diese Arbeit wurde von BBSRC Forschungsstipendien BB / G013993 / 1 und BB / D004055 / 1 an IM unterstützt, und ein BBSRC Doctoral Training Award und Clarendon Stipendium an CK

Materials

Perfluorodecalin F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK FLUTEC PP6
Poly(dimethylsiloxane) gum  Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA Item # 132700 Carolina Observation Gel
Cavity Microscope Slides VWR International Ltd, Lutterworth, UK 10118-600 Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice
Cyanoacrylate glue Loctite 604753 Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice
Cellulosic cellophane membrane AA Packaging Limited, Preston, UK 325P cellulose film; 80mm disc
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References

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Kirchhelle, C., Moore, I. A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development. J. Vis. Exp. (123), e55331, doi:10.3791/55331 (2017).
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