Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling
Summary
Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.
Abstract
Verschillende aspecten van plantontwikkeling, zoals laterale wortelmorfogenese, gebeuren op tijdsperioden van meerdere dagen. Om onderliggende cellulaire en subcellulaire processen te bestuderen, zijn microcontopiestrategieën met hoge resolutie, die de fysiologische omstandigheden behouden, vereist. Plantweefsels moeten voldoende voedings- en watertoevoer hebben met duurzame gasuitwisseling, maar wanneer ze onderdompeld en geïmmobiliseerd zijn onder een deklaag, zijn ze bijzonder gevoelig voor anoxie. Een succesvolle strategie is het gebruik van een perfusiesysteem om een constante voorraad zuurstof en voedingsstoffen te behouden. Zulke afspraken kunnen echter ingewikkeld, omslachtig zijn en vereisen gespecialiseerde apparatuur. Hier gepresenteerd is een alternatieve strategie voor een simpel beeldvormend systeem dat gebruik maakt van perfluorodecaline als een onderdompelingsmedium. Dit systeem is makkelijk op te zetten, vereist minimale apparatuur en kan gemakkelijk op een microscoopfase worden gemonteerd, waardoor meerdere beeldkamers kunnen worden opgesteld en afgebeeld in parenallel. In dit systeem zijn laterale wortelgroeipercentages voor de eerste twee dagen onderscheiden van groeitempo's onder standaard omstandigheden op agarplaten, en laterale wortelgroei blijft gedurende ten minste nog een dag met verminderde tarieven. Plantweefsels worden geleverd met voedingsstoffen via een agarplaat die ook kan worden gebruikt om een reeks farmacologische verbindingen te beheren. Het systeem werd opgericht om laterale wortelontwikkeling te monitoren, maar is gemakkelijk aan te passen aan andere plantenorganen zoals hypocotylen en primaire wortels.
Introduction
Om cel- en subcellulaire processen te onderzoeken die de ontwikkeling van planten ondersteunen, is er een toenemende vraag naar langetermijn-time-lapse imaging strategieën. Een belangrijke uitdaging bij dergelijke imaging-experimenten is het behoud van fysiologische omstandigheden, waaronder voldoende gaswisseling, plus een aanvoer van water en voedingsstoffen 1 , 2 , 3 . Om doelstellingen te gebruiken met hoge numerieke diafragma's voor optimale optische resolutie, dienen de specimens in de nabijheid te worden geplaatst en parallel aan de deklip gericht. Bewegingen in de x-, y- en z-richting dienen bij voorkeur ideaal tijdens beeldvorming.
Terwijl zaailingen vaak worden gemonteerd in water of waterige oplossing voor korte termijn beeldvorming, heeft water een lage capaciteit om CO 2 en O 2 (respectievelijk 1,54 mg / ml en 0,04 mg / ml respectievelijk bij 20 ° C, 0,1 MPa) op te lossen 4 , wat maaktHet is ongeschikt voor uitgebreide tijdverlopen experimenten. Perfusie systemen die constante niveaus van zuurstof en nutriënten handhaven, zijn een oplossing voor dit probleem en zijn ontwikkeld voor zowel de confocal laser scanning microscopie (CLSM) 1 , 2 , 3 en lichte microscopie (LSM) 5 . Systemen zoals de RootChip 2 en de RootArray 3 zijn speciaal ontworpen voor de tijdverliesbeelden van ontwikkelende wortels en omvatten ontkiemende zaden in een op maat gemaakte multi-specimen apparaat. Deze regelingen zorgen voor minimale mechanische verstoring en zijn ontworpen voor de parallelle analyse van meerdere zaailingen, maar zijn niet geoptimaliseerd voor beeldvorming van subcellulaire structuren. Calder en collega's hebben een complexere perfusiegebaseerde beeldkamer ontwikkeld die is geoptimaliseerd voor het imaging van subcellulaire structuren waarin het monster in positie wordt gehouden door een gaasOm het gebruik van hoge vergrotingsdempers toe te staan 1 .
Hier is een alternatieve, eenvoudige oplossing voor dit probleem, dat niet gebaseerd is op perfusiesystemen, maar maakt gebruik van perfluorodecaline (PFD), een perfluorkoolstof die onlangs gewild is als montagemedium voor Arabidopsis imaging 6 , 7 , 8 . Bij dergelijke toepassingen maakt de hoge capaciteit van PFD voor het oplossen van CO 2 en O 2 (1,9 g / ml voor O 2 in PFD in vergelijking met 0,04 mg / ml in water) 9 , gasuitwisseling door het ondergedompelde weefsel mogelijk. Bovendien is PFD niet-fluorescerend en de brekingsindex (1.313) is vergelijkbaar met die van water (1.333) en is dichter bij die van cytosol (~ 1.4) dan lucht (1.000) 6 . Parfluorkoolwaterstoffen zijn gemeld dat ze een minimale fysiologische werking hebben op een verscheidenheid aan planten en plantenKwesties 6 , met radijszaadjes die gemakkelijk ontkiemd worden wanneer ze in PFD gedompeld worden en normale groei en ontwikkeling gedurende tenminste twee volle dagen vertoont wanneer ze worden geleverd met water 10 . Soortgelijke waarnemingen zijn gemaakt voor ontkiemende Arabidopsis zaden 6 . Gebaseerd op gestimuleerde Raman verstrooiing om de verspreiding van PFD in Arabidopsis bladweefsels na infiltratie direct te bepalen, concluderen Littlejohn en collega's dat PFD waarschijnlijk niet door levende cellen 8 wordt opgenomen. PFD is eerder voornamelijk gebruikt voor beeldluchtweefsels, waar het de beelddiepte aanzienlijk verhoogt, aangezien het gemakkelijk luchtruimen infiltreert door zijn lage oppervlaktespanning 6 . Hier wordt PFD aangenomen voor langdurige confocale beeldvorming van ontwikkelende laterale wortels. In deze configuratie worden één of meer zaailingen geplaatst op een plaat van groeimedium dat met agar wordt gestard en ondergedompeld in PFD. De PFD laat gAseous uitwisseling in de beeldkamer, het voorkomen van anoxie. PFD is zeer vluchtig, zodat het door een pakking van poly (dimethylsiloxaan) gom wordt gehouden, die ook een hoge gasdoorlaatbaarheid heeft (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 voor CO 2 ) 11 . Voedingsstoffen en water worden geleverd door middel van de plaat van het medium dat met agar wordt gestolven. Tegelijkertijd drukt deze agarplaat voorzichtig de wortel tegen de deklaag, waardoor de relatieve positie in de beeldkamer wordt bevestigd en het gebruik van wateroplosbare lenzen met hoge resolutie mogelijk maakt. Bovendien kan de agarplaat gebruikt worden om een reeks farmacologische behandelingen te beheren, waaronder dexamethason, oryzalin en isoxaben. De imagingkamers kunnen in grote aantallen worden samengesteld uit standaard microscopische dia's met behulp van minimale apparatuur. De imagingkamers werden ontwikkeld en gekenmerkt om laterale wortelontwikkeling te bestuderen, maar zijn aan te passen aan het imaging van andere zaailingsorganen zoals primaire wortelpunten enhypocotylen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die hier wordt gepresenteerd is een simpele strategie voor confocal beeldvorming met hoge resolutie voor twee tot drie dagen. Bij perioden tot 48 uur werden geen nadelige effecten van het beeldvormingssysteem op de laterale wortelontwikkeling waargenomen. Na 48 uur begon de gemiddelde laterale wortelgroei te vertragen, hoewel een aanzienlijke subset van de wortels (37%) bleef groeien tegen tarieven die vergelijkbaar waren met de gemiddelde wortelgroei op platen. Daarom, door het imago van een voldoende groot aantal wortels, kunnen wortels wier groei vertraagt na 48 uur uitgesloten worden. Systematische tests van de beeldkamers werden niet uitgevoerd voor perioden langer dan 72 uur, maar alternatieve strategieën worden aanbevolen als verlengde beeldvormingstijden gewenst zijn. Imagingkamers kunnen voortdurend op het microscoopstadium worden gelaten, indien passende milieuomstandigheden worden verstrekt, of naar een groeifaciliteit worden verwijderd en periodiek teruggestuurd naar de microscoop. Hierdoor kunnen talloze kamers parallel worden weergegeven. </ P>
Een voordeel van de hier beschreven kamers is dat zijwortels in hun positie zijn bevestigd en kunnen worden afgebeeld met behulp van hoge resolutie waterdempende lenzen. De ruimtelijke stabiliteit hangt kritisch af van de agarconcentratie die in de ondersteunende agarplaat gebruikt wordt. Aanvankelijk werden een aantal verschillende concentraties van 0,8% agar tot 2% agar getest, waarbij bleek dat hoge concentraties in dit bereik stabiel wortels in de ruimte vastzetten, maar de wortelgroei vertraagde sneller en sommige wortels vertoonden tekenen van mechanische stress, inclusief verminderde celverlenging. Daarentegen leverden de lage agarconcentraties niet de benodigde ondersteuning en wortels drijven in x, y en z tijdens de beeldvorming. De optimale 1,5% agarplaat regelt de positie van het monster zonder nadelige mechanische effecten. Onder deze omstandigheden, na het afrekenen in de eerste 30 minuten of zo, zijn de wortels stabiel over vele uren, waardoor de overname van data overnacht wordt. Tijdens de aanschaf van 4D-gegevens waren z-stapelbereiken typisch bRacketed met een extra 5-10 μm, maar dit was voornamelijk geschikt voor buiten-vlakke groei van laterale wortels in plaats van z-drift of wobble. Hoewel de standaard agar concentratie wat weerstand biedt tegen penetratie, zullen de gravitropisch groeiende wortels uiteindelijk de agar binnendringen. Door een kleine wijziging van de beeldkamer kan de wortelgroei echter evenwijdig aan de deklip worden gehouden, waardoor oudere laterale wortels en primaire wortels kunnen worden afgebeeld. Bovendien kan de basisbeeldkamer gemakkelijk worden aangepast voor hypocotylen. Hypocotylen zijn meer vrij drijvend in dit systeem, zodat de z-as-beugel voor beeldverwerving gewoonlijk is verhoogd tot ongeveer 20 μm. In deze studie werd een regop microscoop doorheen gebruikt, waardoor de substraateigenschappen mogelijk werden gecontroleerd. De afbeeldingscamer kan aangepast zijn aan omgekeerde microscoopconfiguraties, maar de tijdsafhankelijke invloed van de stijve deklip op onderscheidende organen moet geëvalueerd worden. </p>
Littlejohn en collega's hebben erop gewezen dat PFD zelf niet biologische molecules gemakkelijk oplosbaar maakt, wat betekent dat het niet direct kan worden gebruikt voor de afgifte van farmacologische verbindingen 7 . Dit probleem werd overwonnen door zulke verbindingen te leveren door middel van de plaat van gestolde groeimedium waarop de agarplaat rust. Terwijl perfusiesystemen de gekozen methode blijven voor uitwasproeven, is de beeldkamer met succes gebruikt voor de toediening van dexamethason 12 en andere verbindingen. Een opmerking, terwijl dit artikel in voorbereiding was, heeft Wagenheim en collega's 18 een kamer beschreven voor het imaging van laterale wortelontwikkeling met behulp van lichte-bladmicroscopie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Prof. Geoffrey Wasteneys, Universiteit van Brits Colombia, voor zaaduitdrukking van RFP-TUB6 en een anonieme recensent voor nuttige correcties. We zijn dankbaar aan prof.dr. Hugh Dickinson om ons te waarschuwen voor het gebruik van cellulose film als mechanische ondersteuning en voor John Baker voor fotografie. Dit werk werd ondersteund door BBSRC onderzoeksbeurzen BB / G013993 / 1 en BB / D004055 / 1 naar IM, en een BBSRC Doctoral Training Award en Clarendon Scholarship aan CK
Materials
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc | |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
