The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.
이 문서는 포함 된 폴리 카보네이트 (PC) 화학적 산소 그라디언트의 조합에 따라 세포 이동을 연구하는 박막 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 제조 된 미세 유체 소자를보고합니다. 모두 화학적 산소 그라디언트 크게 생체 내에서 세포의 이동에 영향을 미칠 수있다; 그러나, 기술적 제한으로 인해 거의 연구 시험 관내에서의 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 본 연구에서 개발 된 장치는 원하는 화학적 구배를 생성하는 구불 구불 한 형상의 채널이 일련의 활용 및 산소 구배 발생을위한 공간적 한정 화학 반응 법을 이용한다. 화학적 산소 그라디언트의 방향은 간단 마이그레이션 결과 해석을 가능하게하는 서로 수직이다. 효율적 최소한 화학 소비 산소 구배를 생성하기 위하여, 내장 된 PC 박막 기체 확산 장벽으로서 이용된다. 개발 된 미세 유체 장치주사기 펌프에 의해 작동 및 설정 단순화 및 최적화 세포 배양 조건을 허용하는 세포 이동 실험 동안 종래의 세포 배양기에 배치 될 수있다. 세포 실험에서, 우리는 (간질 세포 유래 인자, SDF-1α)와 산소 구배 케모카인의 조합에 따라, adenocarcinomic 인간의 폐포 기저 상피 세포, A549의 마이그레이션을 연구하기 위해 장치를 사용했다. 실험 결과는 장치가 안정적으로 수직 케모카인 및 산소 구배를 생성 세포와 호환 할 수 있음을 보여준다. 마이그레이션 연구 결과는 산소 그라데이션 그라데이션의 조합이 하나의 그라디언트 미만에서 예측할 수 없습니다 아래 세포 이동을 유도에 중요한 역할 및 셀룰러 동작을 재생할 수 있음을 나타냅니다. 이 장치는 더 생체 -like microenvi 더 나은 세포 이동 연구를 홍보 할 수있는 세포 배양에 화학적 산소 그라디언트 사이의 상호 작용을 연구하는 연구자를위한 강력하고 실용적인 도구를 제공합니다경으로.
가용성 인자 및 산소 장력의 공간적 분포는 생체 1, 2, 3, 4에 중요한 세포 기능의 수를 조절할 수있다. 보다 세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 안정 화학적 산소 구배를 생성 할 수있는 시험 관내 세포 배양 플랫폼은 매우 바람직하다. 다양한 수용성 요소는 생물학적 활성에 중요한 역할을하고 세포의 행동에 영향을 미친다. 최근에 의한 미세 유체 기술의 발전에 안정적으로 생성하는 화학 증감 가능한 미세 유동 장치의 수는 세포 이동 5를 연구 개발되고있다. 또한, 여러 연구는 또한 시험 관내 세포 배양 6, 7, 8 산소 장력의 필요성을 밝혀냈다. 하나,세포 배양을위한 산소 장력의 제어는 주로 가압 가스 실린더와 산소 소거 또는 셀 창업 보육 센터에 대한 직접적인 화학 물질 첨가에 의존한다. 직접 화학 물질 첨가는 세포 배양 배지를 바꾸고 세포 반응에 영향을 미친다. 산소 제어 인큐베이터 인큐베이터 특수 설계, 정확한 가스 유량 제어, 저산소증 조건을 달성하기 위해 질소 가스의 큰 부피를 필요로한다. 또한, 다양한 산소 및 장력 구배 하에서 셀룰러 동작 연구를 지연시킨다,이 설정을 사용하여 산소의 공간 분포를 제어하기 불가능하다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 유체 소자의 수는 세포 배양 애플리케이션 9 산소 구배를 생성하기 위하여 개발되었다. 그러나, 이들 대부분은 증발 및 버블 발생의 문제가 발생할 수 가압 된 가스를 사용하여 작동된다. 따라서, 그들은 종종 정교한 장비를 필요로하고 장기 세포 배양 STUDIE에 대한 신뢰할 수 없습니다에스.
과제를 극복하고, 상기 세포 이동에 대한 화학적 산소 구배 사이의 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 내장 된 폴리 카보네이트 (PC), 박막 (10), 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 미세 세포 배양 장치를 개발했다. 장치는 PDMS 막에 의해 분리 된 두 개의 미세 채널 층으로 구성된다. 상부층은 산소 구배 발생을위한 PDMS-PC 층이고; 바닥층은 화학적 구배 생성 및 세포 배양 PDMS로 만들어진다. 장치는 동시에 가스 실린더 정교한 유동 제어 시스템을 사용하지 않고 수직 화학적 산소 구배를 생성 할 수있다. 장치에서 PDMS 큰 광학 투명성, 가스 투과성 및 세포 배양 및 이미징을위한 생물학적 호환성을 제공합니다. 내장 된 PC 필름은 효율적인 산소 장력 제어하는 가스 확산 배리어로서 기능한다. 미세 유체 채널에서는 채널 구불 구불 한 형상의 연속 사용의 화학 그라디언트를 생성합니다. 디자인은 크게 때문에 그것의 신뢰성과 쉽게 실험 장치에 다양한 애플리케이션을위한 마이크로 유체 장치에서 화학 그라디언트를 생성하는 데 이용되고있다. 또한, 화학적 구배 프로파일은 수치 시뮬레이션으로 미리 채널 형상을 변화시킴으로써 설계 할 수있다. 산소 구배의 생성을 위해, 우리는 이전 연구실 10, 11, 12에서 개발 된 공간적으로 한정된 화학 반응 법을 이용했다. 산소는 질소 퍼징없이 지정된 영역에서 청소할 수있다. 생물 실험실에서 실제 사용을 위해, 전체 실험 장치는 기존의 세포 배양 인큐베이터와 호환됩니다. 이러한 방법을 통합함으로써, 우리는 동시에 세포의 이동을 연구하기 위해 대량 가스 실린더와 정교한 장비없이 안정적인 화학적 산소 그라디언트를 생성 할 수 있습니다.
임베디드 PC 박막으로 PDMS를 미세 유체 소자를 제조하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : PDMS-PC 최상부 층의 제조 (2) 확인하는 동안 PDMS로 예비 중합체를 PC 필름을 삽입 할 때 (1) 모든 거품 추방 프로세스를 경화 모든 PDMS는 잘 수평 수평면에서 수행됩니다. 세포 이동의 실험을 위해, 가장 중요한 단계는 : (1) 미세 유동 장치 내의 기포를 제거 실험 동안 튜브, 주사기 펌프; (2) 미세 유동 장치는 세포 이동의 관찰 생균 촬상 중에 잘 – 계층화 수평면 상에 배치되는 것을 보장; (3) 실험 동안 페트리 접시에 O DDH이 부가 물은 밖으로 건조되어 있지 않은지 확인하여 수분 유지 장치.
성공적으로 박리없이 PDMS-PC 하이브리드 미세 유체 소자를 제작하기 위해서는, PC 좋 동안 모든 기포를 제거하는 것이 중요필름 삽입. PC의 막을 천천히 PDMS 프리폴리머로 PC 필름의 삽입시 거품 발생을 방지하기 위해 (약 15 ~ 30도 정도 떨어진 PDMS 프리폴리머면)에서 비스듬히 삽입 될 수있다. 필요한 경우, 임베디드 PC 막을 전체 PDMS 예비 중합체 갇힌 기포를 배출하기 위해 10 분간 진공 펌프에 연결된 건조기에 배치 될 수있다. PC의 막을 진공 공정 후에 수레 경우 피펫 팁은 경화 된 PDMS 층 상 PC 필름을 눌러하는데 사용될 수있다. 필요한 경우 진공를 눌러 프로세스를 반복합니다.
세포 실험에 기포의 부족은 미세 세포 배양 중요하다. 공기 방울이 연결하기 (주사기 펌프, 튜브 및 미세 유체 장치를 포함) 전체 미세 유체 설정에 도입되어 있지 않은지 확인합니다. 기포 기인의 expe의 승온 하에서 기체의 용해도를 감소시키기 위해 마이크로 유체 설치 이내 경우배양기 내부 riments는 (피로 갈롤, 성장 배지를 포함하고, 수산화 나트륨) 및 시약 (주사기와 튜브를 포함한) 모든 실험 요소는 온도 변동을 최소화하기 위해 (적어도 20 분에는 사전에) 미리 인큐베이터에 배치 될 수있다 . 주사기들은 펌프 내부의 모터의 동작에서 발열 펌프. 인큐베이터 안에 주사기 펌프를 작동 일반적으로 허용; 그러나, 실험하는 동안 인큐베이터 온도를 확인 할. 온도는 실험시 이르게되면 추가적인 냉각 과정이 수행 될 필요가있다. 여러 가능한 냉각 방법은 예컨대, 인큐베이터에 얼음 상자를 배치 인큐베이터 내에 배치 주사기 펌프의 수를 줄이거 나 강제 냉각 장치를 인큐베이터를 사용으로 사용될 수있다.
본 연구에서 개발 된 PDMS-PC 미세 세포 배양 장치를 확실 FO 수직 화학적 산소 구배를 발생시킬R 세포 이동 연구. 현상 장치의 한계가 발생 산소 구배 프로파일은 장치를 통해 주위 환경으로부터 화학 반응 소기 구동 산소 유량, 산소 확산 사이의 균형에 의존하고, 상기 매체에 있다는 것이다. 그 결과, 산소 구배 프로파일은 임의적으로 장치 내부를 제어 할 수 없다. 기존 미세 세포 배양 플랫폼에 비해, 본 연구에서 개발 된 장치는 화학적 산소 구배의 조합에 따라 세포 배양 실험을 수행 할 수있는 첫 번째이다. 전체 장치는 지루한 정렬 및 고가의 장비없이, 종래 소프트 리소그래피 복제 성형 공정을 이용하여 제조 될 수있다. 기울기는 수치 시뮬레이션 및 실험적 시험 관내 세포 연구 이상의 생체 미세 형상의 조건을 제공하는 것을 특징으로 할 수있다. 가스 디으로서 PC 필름 공간적으로 한정된 화학 반응 법을 이용하여ffusion 장벽 산소 구배 가압 가스 실린더 정교한 가스 유량 제어 장치를 사용하지 않고 생성 될 수있다. 또한, 설치 화학 소량 (하루 미만 10 ㎖) 산소 구배를 유지하기 위해 필요하다. 산소 장력 제어는 마이크로 유체 관 주위에 국부적으로 한정되고, 대기 산소 농도를 방해하지 않기 때문에, 전체 설정 추가적인 온도, 습도없이 종래의 세포 배양 인큐베이터 내에 배치하고, CO 2 제어 계측 할 수있다. 그 결과, 발전 장치는 실질적 생물 실험실에서 사용하는 잠재력을 갖는다.
기술적 한계로, 산소 긴장에서 휴대 행동은 거의 기존 문헌 연구되지 않았다. 본 연구에서 개발 된 장치의 도움으로, 산소 구배 하에서 세포 배양을 크게 산소 구배 하에서 세포 연구를 촉진하는 용이 한 방식으로 수행 될 수있다. 작고에hermore 유사한 동작 원리가 시험 관내 세포 배양 물 (17)을 연구를 들면 이산화탄소 및 질소 산화물과 같은 생리 학적으로 중요한 다른 기체 그라디언트를 생성하기 위해 적용될 수있다. 이러한 기능은 PDMS-PC 미세 유체 장치는 체외 세포 배양 연구에 진출, 약물 검사 및 세포 증식 및 마이그레이션 분석 등 다양한 세포 배양 응용 프로그램을위한 큰 잠재력을 보여주고 있음을 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.
1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
150 mm Petri-Dish | Dogger Science | DP-43151 | |
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
DMEM/ F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |