Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

ייצור 1. של המכשיר microfluidic הערה: מכשיר microfluidic כולו מפוברק באמצעות תהליך הדפוס העתק ליתוגרפיה הרך 13. ייצור של תבניות עבור שכבות PDMS במכשיר microfluidic עיצוב דפוסי הערוץ microfluidic באמצעות המחשה זמינה מסחרי או ציור תוכנה. שלח את הקובץ לחברה עבור photomask שקיפות ברזולוציה גבוהה הדפסת 14. פרוסות סיליקון נקי עם אצטון (≥99.5%), אלכוהול איזופרופיל (IPA; ≥99.9%), ו לחרוט תחמוצת שנאגרו (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). לשטוף עם deionized (DI) מים מייבשים את פרוסות עם אקדח חנקן. ספין מעיל המשוער 20 גרם של photoresist הטון השלילי, SU-8 2050, על ופלים ב 500 סל"ד במשך 15 שניות ולאחר מכן 2,000 סל"ד למשך 30 שניות. הערה: תנאי ציפוי הספין אמור להניב SU-8 2050 צילוםלהתנגד שכבות בעובי של כ 75 מיקרומטר על הוופלים לאחר ליתוגרפיה אופטית. לאפות Soft הוופלים על פלטה חמה C 65 מעלות במשך 3 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 9 דקות. לאחר לאפות הרכים, לחשוף את הפרוסות באמצעות aligner מסכה עם מסכות השקיפות עוצבו תחת אור UV; האנרגיה סך החשיפה צריך להיות בערך 300 mJ / 2 ס"מ. לאפות לאחר חשיפה (PEB) ופלים ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר PEB, לטבול את הפרוסות ב מפתח SU-8 עם תסיסה חזקה או באמבטיה קולית (37 קילוהרץ ו -180 כוח קולי יעיל W) עבור 7 דקות. שוטפים את פרוסות סיליקון עם אצטון IPA להסיר את SU-8 שיורית. מניחים את פרוסות ו 100 μl של silane (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) לתוך צלחת 6 ס"מ קוטר פטרי ייבוש הקשורים משאבת ואקום הסרעפת עבור silanization משטח רקיק כדי למנוע מליטה רצויים. הפעל את המשאבה במשך 15 דקות, לכבות אותו, ולאטום את הייבוש עם ואקום למשך 30 דקות. קח את פרוסות silanized מתוך ייבוש ואת קלטת אותם ל -15 מנות ס"מ קוטר פטרי לתהליך ליתוגרפיה רך הבאים: ייצור והרכבה של שכבות PDMS הכנת הפולימר מראש PDMS מערבבים מונומר PDMS (בסיס) ואת סוכן ריפוי בכל 10: 1 יחס (v / v). דג את תערובת התקנת הייבוש למשך 60 דקות. המצאה של שכבת PC-מוטבע העליונה העברת 2 גרם של PDMS מראש פולימר על התבנית עם דפוסי ערוץ fluidic-השכבה העליונה כדי ליצור שכבה דקה של PDMS. מניחים את התבנית בתוך ההתקנה ייבוש דגה את PDMS למשך 60 דקות. מניחים את לילה עובש בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך ריפוי PDMS. ודא כי העובש הוא על משטח אופקי. לצנן את התבנית לטמפרטורת החדר. יוצק -13 גרם נוסף של מראש פולימר PDMS על התבנית ודג את PDMS ב הדואר התקנת ייבוש למשך 60 דקות. לאט להטביע סרט PC בעובי 1 מ"מ לתוך שכבת PDMS הטריה כמחסום דיפוזיה גז; לגרש כל בועות במידת הצורך. שים את לילה עובש בתנור 60 מעלות צלזיוס, ולוודא שזה על משטח אופקי. לצנן את PDMS נרפא לטמפרטורת החדר. חותכים את המכשיר עם אזמל על שטח של כ 5.5 x 5 ס"מ 2, אשר יכול לכסות את כל דפוסי ערוץ, לקלף את לוח PDMS מהתבנית. פונץ 'חורים עבור צריכת האוויר של שקעים באמצעות אגרוף ביופסיה 2 מ"מ בקוטר. אחסן את שכבת PDMS-PC העליונה המפוברקת הרחק אבק הסביבה להרכבה מאוחר יותר. המצאה של שכבת PDMS התחתונה יוצקים 11 גרם של מראש פולימר PDMS על עובש על השכבה התחתונה. מניחים את התבנית בתוך ייבוש דגה את PDMS למשך 60 דקות. שמור על לילה עובש בתנור C 60 ° כדי לרפא את PDMS. ודא כי הוא שוכב על משטח אופקי. להתקרר הPDMS דואר לטמפרטורת החדר. חותכים את המכשיר על שטח של כ 5.5 x 5 ס"מ 2, אשר יכול לכסות את כל דפוסי הערוץ, לקלף אותו של עובש. אחסן את שכבת PDMS התחתונה המפוברקת הרחק אבק הסביבה להרכבה מאוחר יותר. המצאה של הממברנה PDMS ספין מעייל 4 גרם משוער של טרום פולימר PDMS על גבי פרוסות ריקות silanized ב 100 סל"ד במשך 90 שניות ולאחר מכן 3,000 סל"ד במשך 4 שניות. אופים את פרוסות סיליקון מצופה ספין בתוך 60 ° C בתנור למשך הלילה. ההרכבה של המכשיר מניח את השכבה העליונה PDMS-PC מפוברק רקיק עם קרום PDMS מצופה ספין במכונת טיפול פני שטח O 2 פלזמה עם המשטחים המליטים הפונים כלפי מעלה. פנק את משטחי PDMS עם 90 ואט של פלזמת O 2 במשך 40 שניות. איגרות החוב השכבה העליונה על הממברנה PDMS מיד לאחר הטיפול משטח פלזמה O 2. מניחים משקל (כ -600 גר ') על גבי שכבות מלוכדות ולשים אותם בתוך60 ° C בתנור למשך הלילה כדי לקדם מליטה. לצנן את השכבות המלוכדות לטמפרטורת חדר וחותך את הקרום מלוכד אל השכבה העליונה עם אזמל על שטח של כ 5.5 x 5 סנטימטר 2, אשר יכול לכסות את כל דפוסי הערוץ. לקלף את המבנה מלוכד מן פרוסות סיליקון ו מחורר על פתחי הכניסה והיציאה של ערוץ השיפוע הכימי באמצעות אגרוף ביופסיה 2 מ"מ בקוטר. מניח את שכבת מלוכדות הקרום העליונה ואת השכבה התחתונה PDMS מפוברק במכונה משטח טיפול O 2 פלזמה, עם המשטחים המליטים פונה כלפי מעלה, כדי להפעיל את משטחי PDMS באמצעות הפלזמה ב 90 ואט במשך 40 שניות. צרף השכבות העליונות ותחתונות יחד מליט מייד לאחר טיפול פני השטח. מניחי משקל (כ -600 גר ') על גבי המכשיר מלוכד כולו לשים אותו בתוך 60 ° C בתנור למשך לילה. קח את התקן מפוברק כולו מהתנור להתקרר אותו לטמפרטורת החדר. 2. Assay נדידת תאים Microfluidic הערה: במאמר זה, אנו משתמשים שורת תאים נפוץ, תא אפיתל הבסיס המכתשית האדם adenocarcinomic (A549), וכן chemokine, תא סטרומה גורם נגזר (SDF-1α), כדוגמאות. חוקרים העובדים על תאים אחרים וכמוקינים, בבקשה להתאים את תהליכי הניסוי בהתאם. יום 0: תא הכנה תרבות המנייה של תאי A549 במדיום גידול מלא המכילים DMEM F12 תחליף L- גלוטמין, 10% (V / V) בסרום שור עוברי (FBS), ו -1% (v / v) פתרון antimycotic antimicrob. תת-תרבות על ידי ניתוק עם 0.25% טריפסין- EDTA. כן השעיות תא עבור הניסויים על ידי צנטריפוגה תאים ניתקו ב 140 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר. עבור הניסויים המכשיר microfluidic, לספור את התאים באמצעות hemocytometer וזרעי לפחות 1 x 10 6 תאים בבקבוק T75 עם 10 מ"ל של שלמהמדיום גידול. הערה: כל תהליכי תרבית תאים מבוצעים באינקובטור עם 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אווירה. יום 1: הכנת התקן מניחים את המכשיר למכונת פלזמה O 2 ומתייחסים אליה פלזמה O 2 ב 90 וואט במשך 40 שניות כדי להבהיר את ערוץ microfluidic משטחים הידרופילי. מייד לאחר טיפול פני השטח, להתקין שתי 14 G מחטים בוטות על ידי החדרת המחטים ישירות לתוך החורים בקוטר 2 מ"מ אגרוף לתוך שכבת PDMS על צריכת האוויר של ערוץ השיפוע הכימי. ודא כי המחטים אינם חוסמים את ערוצי microfluidic. צייר 0.8 מ"ל של DDH 2 O באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 14 G בוטה. להזריק את DDH 2 O לתוך תעלת השיפוע הכימי משקע עד שהמים זורמים החוצה משתי המחטים על צריכת האוויר. הכן 1 מ"ל של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון פיברונקטין ידי דילול המניות פיברונקטין עם Dulbecco & #39; s פוספט-בופר (DPBS). להשרות פתרון פיברונקטין המשקע של ערוץ השיפוע הכימי באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 14 G בוטה עד הפתרון זורם החוצה משתי המחטים על צריכת האוויר. דגירת לילה המכשיר כולו בתוך תרבית תאי חממה קונבנציונלית. הדמית זריעת תאים במיקרוסקופ: יום 2 זריעת תאים לשאוב את המדיום מתאי כי היו בתרבית מאז יום 0 לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של DPBS 2 פעמים. לשאוב DPBS, להוסיף 2 מ"ל של טריפסין-EDTA, דגירה התאים בחממה במשך 5 דקות כדי לנתק את התאים מפני השטח הבקבוק. המתן עד תאים מנותקים ותלויה הפתרון ולהוסיף 8 מ"ל של מדיום סרום ללא (DMEM F12 + 1% (v / v) antimicrob-antimycotic פתרון) אל הבקבוק. להעביר את כל הנוזל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות אותו ב 140 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li> לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה ולהוסיף כמות מתאימה של המדיום סרום חופשיים להפיק את צפיפות התאים הסופי 1 x 10 6 תאים / מ"ל. קח את המכשיר microfluidic מוכן ביום 1. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או מכשיר אחר ספירת תאים אוטומטי. להזריק סרום ללא בינוני משקע של ערוץ שיפוע כימיים באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 14 G בוטה עד בינוני זורם החוצה משני מחטים על צריכת האוויר. להזריק 200 μl של השעית התא המשקע של ערוץ השיפוע הכימי. שים את תא תרבית תאים במכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לאשר כי התאים הוכנסו לערוץ microfluidic. מניחים את המכשיר לתוך מיכל לח (למשל, קופסת פלסטיק עם DDH 2 O בפנים) ולשמור אותו בתוך חממה תרבית תאים עבור 5 שעות כדי לקדם את הידבקות של תאים על פני השטח את המכשיר. הכנת reagהמציג לייצור שיפוע כימי הכן את כימיים (-1α SDF) בריכוז הרצוי (100 ng / ml) במדיום סרום ללא. צייר את סרום ללא בינוני עם ובלי כימי לשני מזרקים נפרד 3 מ"ל מחובר צינורות טוהר גבוהה. הגדר את המזרקים על משאבת מזרק עם קצב זרימה של 1 μl / min לשימוש מאוחר יותר. הכנת ריאגנטים עבור דור שיפוע חמצן הפוך 15 מ"ל של 1 פתרון M NaOH ו -15 מ"ל של 200 מ"ג / מ"ל ​​pyrogallol פתרון. צייר את NaOH ופתרונות pyrogallol לשני מזרקים נפרד 15 מ"ל מחובר צינורות PTFE טוהר גבוהה צינורות טוהר גבוהה, בהתאמה. הגדר את המזרקים על משאבת מזרק עם קצב זרימה של 5 μl / min לשימוש מאוחר יותר. הגדרת המכשיר microfluidic לאחר דגירה 5 שעות, לקחת את המכשיר כולו החוצה והנח אותה על צלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ. תקן את המכשיר בצלחת פטרי באמצעות מרק דבק. מעביר אתצלחת פטרי כדי מיקרוסקופ הדמיה תא חי באינקובטור. חבר את הצינורות מן המזרקים עבור דור השיפוע הכימי אל פתחי הכניסה של ערוץ השיפוע הכימי. חבר היציאה אל צינורות המובילים למאגר פסולת. הפעל את משאבת המזרק עם המזרקים עבור דור שיפוע כימי. חבר את הצינורות הטוהרים הגבוהה מן המזרקים המכילים NaOH ו pyrogallol אל פתחי הכניסה של ערוץ שיפוע חמצן. חיבור צינורות לשקע כדי לאסוף את הפסולת. הפעל את משאבת המזרק עם המזרקים עבור דור שיפוע חמצן. מוסיף כ 15 מיליליטר של DDH 2 O כדי בצלחת פטרי כדי להרחיק את המכשיר הלח. הגדר את המיקרוסקופ הדמיה תא חי עבור לכידת תמונה-שפקע הזמן, ולקחת תמונה כל 15 דק '. יום 3: איסוף נתונים וניתוח העבר את קובצי התמונה שצולמה למחשב. לנתח את התמונות באמצעות דימוי קוד פתוחalysis תוכנה, ImageJ, עם תוסף קוד פתוח עבור מעקב ידני (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) ומתוכנת Chemotaxis כלי חינם (http://ibidi.com/xtproducts / he / תוכנה-ו-תמונה-ניתוח / ידני-תמונה-ניתוח / Chemotaxis-ו-הגירה-כלי) 15, 16. אפיון 3. ההדרגתיים הערה: ההדרגתיים הכימית וחמצן ניתן לאפיין לפני או אחרי ניסויי התא. סימולציה נומרית של השיפוע הכימי להעריך את אופי הזרימה למינרית של מיקרופלואידיקה באמצעות דינמיקה fluidic חישובית סימולציה (CFD). אפיון ניסיוני של שיפוע חמצן כן צבע פלואורסצנטי רגיש חמצן, טריס (2,2'-bipyridyl) רותניום (III) כלוריד hexahydrate, פתרון במים בריכוז של 5מ"ג / מ"ל. צייר את הפתרון לצבוע רגישים-חמצן לשני מזרקים נפרד 3 מ"ל מחובר צינורות טוהר גבוהה. הגדר את המזרקים על משאבת מזרק עם קצב זרימה של 1 μl / min (זהה הספיקות המשמשות דור השיפוע הכימי). חבר את הצינורות מן המזרקים אל פתחי הכניסה של ערוץ השיפוע הכימי. חבר היציאה אל צינורות המובילים למאגר פסולת. הפעל את משאבת המזרק עם המזרקים עבור דור שיפוע כימי. למדוד את עוצמת הקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם אור העירור עובר דרך מסנן אופטי ננומטר 470 ± 20. אסוף את אור הפליטה דרך פילטר פליטה 515 ננומטר ארוך לעבור באמצעות מצלמת CCD מגניבה. חבר את הצינורות הטוהרים הגבוהה מן המזרקים המכילים NaOH ו pyrogallol אל פתחי הכניסה של ערוץ שיפוע חמצן. חיבור צינורות לשקע כדי לאסוף את הפסולת. הפעל את משאבת מזרק עם מזרקים עבור חמצןדור שיפוע. אסוף את תמונות הקרינה של צבע החמצן רגיש זורם בתא תרבית תאים. עצור את הזרימה לייצור שיפוע חמצן וניתקת את כל הצינורות לערוץ דור חמצן. חיבור צינורות-טוהר גבוה מן בלוני גז לשקע של ערוץ שיפוע חמצן. אסוף את התמונות הקרינה של צבע חמצן רגיש זורם בתא תרבית תאים כאשר זורם אוויר, חנקן טהור, וחמצן טהור לתוך צינורות המחובר לערוץ שיפוע חמצן. להעריך את הדרגתיים חמצן על ידי ניתוח תמונות הקרינה באמצעות המשוואה שטרן-Volmer פי הפניות 10 ו -11.