垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

マイクロ流体デバイスの1製作注：全体のマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィーレプリカ成形工程13を用いて製造されます。 マイクロ流体デバイス内のPDMS層のための金型の作製 市販されているイラストや描画ソフトを使用して、マイクロ流体チャネルのパターンを設計します。 14を印刷する高解像度の透明フォトマスクのために会社にファイルを提出してください。 アセトン（≥99.5％）、イソプロピルアルコールで清浄なシリコンウェハ（IPA;≥99.9％）、および緩衝酸化物エッチング（BOE; 6：1 NH 4 F・HF）。脱イオン（DI）水ですすぎ、窒素銃でウェーハを脱水。 ネガ型フォトレジストのスピンコートおおよそ20グラム、SU-8 2050、15秒間500rpmでウエハー上に、その後、2,000rpmで30秒間。 注：スピンコート条件は、SU-8 2050の写真が得られるはずです光リソグラフィ後のウェハ上に約75ミクロンの厚さのレジスト層を。 ソフトベーク65℃のホットプレート上でウェーハ3分間、その後、9分間95℃。ソフトベーク後、UV光の下で設計された透明マスクを持つマスクアライナを使用してウェーハを露出させます。総露光エネルギーは約300ミリジュール/ cm 2であるべきです。露光後ベーク（PEB）65℃でのウエハ2分間、その後7分間95℃。 PEB後、強い攪拌しながらまたは7分間超音波浴（37 kHzから180 W効果的な超音波パワー）でSU-8現像液にウェハを浸します。残留SU-8を除去するために、アセトン及びIPAでウェハをすすぎます。 望ましくない結合を防止するために、ウエハ表面のシラン化のためのダイヤフラム真空ポンプに接続されたデシケータ内の直径6cmのペトリ皿にウェハシランを100μl（1H、1H、2H、2H- perfluorooctyltrichlorosilane）を置きます。 15分間のポンプの電源をオンにし、それをオフに、30分間真空でデシケータを密封します。 デシケーターのうちシラン化ウェハを取ると、次のソフトリソグラフィ・プロセスのために直径15cmのペトリ皿にそれらをテープ： PDMS層の作製とアセンブリ PDMSプレポリマーの調製 10でPDMSモノマー（ベース）と硬化剤を混合：1の比（v / v）です。 60分間デシケーターセットアップ中の混合物を脱気。 PC-埋め込みトップ層の作製 PDMSの薄層を作るために、トップ層流体チャネルパターンを持つ金型の上にPDMSプレポリマーの転送2グラム。 60分間脱気にPDMSをデシケーターセットアップで金型を配置します。 PDMS硬化のための60℃のオーブンで金型の一晩を置きます。金型は、水平面上にあることを確認してください。 室温に金型を冷却。金型にPDMSプレポリマーの追加の13グラムを注ぎ、目にPDMSを脱気60分間の電子デシケーターのセットアップ。 徐々にガス拡散バリアとして新鮮PDMS層に厚さ1mm PC膜を埋め込みます。必要に応じて任意の気泡を追い出します。 60℃のオーブンで金型の一夜を入れて、それが水平面上にあることを確認してください。 室温に硬化PDMSをクールダウン。すべてのチャネルのパターンをカバーすることができ、約5.5×5 cm 2の領域にメスでデバイスを切断し、鋳型からPDMSスラブをはがします。 直径2mmの生検パンチを使用して、入口と出口のための穴を開ける。離れた後にアセンブリのための周囲の埃から製作トップPDMS-PC層を保管してください。 底部PDMS層の作製底層のための金型上に、PDMSプレポリマーの11グラムを注ぎます。 60分間脱気にPDMSをデシケーター中で金型を配置します。 PDMSを硬化させるために60℃のオーブンで金型一夜にしてください。それは水平面上に横たわっていることを確認してください。 目をクールダウン室温に電子のPDMS。すべてのチャネルのパターンをカバーし、金型のオフにそれを剥離することができ、約5.5×5 cm 2の領域にデバイスをカットします。離れた後にアセンブリのための周囲の埃から製作底PDMS層を保管してください。 PDMS膜の製造 90秒、4秒後、3000 rpmで100 rpmでシラン化ブランクウェハ上にPDMSプレポリマーのスピンコートおおよそ4グラム。オーブンで一晩60°Cでスピンコートされたウェハを焼きます。 装置の組み立て作製したPDMS-PCのトップ層との接合面を上に向けて、O 2プラズマ表面処理機でスピンコートしたPDMS膜付きウェハを置きます。 40秒間O 2プラズマの90 WとPDMSの表面を処理します。 右O 2プラズマ表面処理後のPDMS膜上に上部層を結合。接合層の上に重量（約600グラム）を配置し、それらを置きます接着を促進するために、60℃のオーブンで一晩。 室温に結合された層を冷却し、すべてのチャネルのパターンをカバーすることができ、約5.5×5 cm 2の領域にメスでトップ層に接合膜をカット。 2mmの直径の生検パンチを使用して、化学勾配のチャンネルの入口と出口のシリコンウェハとパンチ孔から結合構造剥がし。 40秒90 Wのプラズマを用いて、PDMSの表面を活性化するために、接合面を上に向けて、O 2プラズマ表面処理機で膜に結合したトップ層と製作PDMS底層を配置します。 表面処理の直後に接着するために一緒にトップとボトム層を取り付けます。全体結合したデバイスの上に重量（約600グラム）を配置し、60℃のオーブンで一晩にそれを置きます。 オーブンから全体製造されたデバイスを取り出し、室温まで冷却します。 2.マイクロ流体細胞遊走アッセイ注：本稿では、例として、一般的に使用される細胞株、adenocarcinomicヒト肺胞の基底上皮細胞（A549）、およびケモカイン、間質細胞由来因子（SDF-1α）を使用します。他の細胞およびケモカインに取り組んで研究者のために、それに応じて実験的なプロセスを調整してください。 0日目：細胞調製 培養するDMEM F12 L-グルタミン代替、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、1％（v / v）のantimicrob – 抗真菌溶液を含む完全増殖培地でA549細胞のストック。 0.25％トリプシンEDTAで解離することにより、サブカルチャー。 室温で3分間、140×gで分離した細胞を遠心分離することにより、実験用の細胞懸濁液を準備します。マイクロ流体デバイスの実験のために、血球計数器を用いて細胞をカウントし、完全10mlでT75フラスコ中に少なくとも1×10 6個の細胞を播種増殖培地。 注：すべての細胞培養プロセスは、37℃、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中で行われます。 1日目：デバイスの準備 O 2プラズママシンにデバイスを配置し、親水性のマイクロ流体チャネルの表面をレンダリングするために40秒間90 WでO 2プラズマでそれを扱います。 すぐに表面処理した後、直接化学勾配路入口におけるPDMS層に打ち抜い直径2mmの穴に針を挿入することにより、2つの14 G鈍い針を取り付けます。針はマイクロ流体チャネルをブロックしないことを確認します。ブラント14 G針で1mlシリンジを使用してのddH 2 Oの0.8ミリリットルを描画します。水が注入口の両方で針から流出するまで、コンセントからの化学勾配路へのddH 2 Oを注入します。 ダルベッコ＆＃とフィブロネクチンの株式を希釈して50μg/ mlのフィブロネクチン溶液1mlを準備39; sのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）。 溶液は入口の両方で針から流出するまで鈍14 G針を有する1mLの注射器を使用して、化学勾配路の出口からフィブロネクチン溶液を注入します。 従来の細胞培養インキュベーター中で、装置全体の一晩インキュベートします。 2日目：細胞の播種および顕微鏡イメージング 細胞播種 0日目以降、培養した細胞からの培地を吸引し、DPBS 5mlの2回で細胞を洗浄。 、DPBSを吸引トリプシンEDTAの2ミリリットルを追加し、フラスコ表面から細胞を分離するために5分間インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 フラスコに細胞が分離し、溶液中に懸濁されるまで待ってから、無血清培地の8ミリリットルを追加（DMEMのF12 + 1％（v / v）のantimicrob – 抗真菌溶液）。 15ミリリットルコニカルチューブに液体のすべてを転送し、室温下で5分間、140×gで、それを遠心します。 </li> 遠心分離後、上清を吸引し、最終細胞密度を1×10 6細胞/ mlを作製するために、無血清培地を適量加えます。 1日目に調製したマイクロ流体デバイスを取り出し、血球計数器または別の自動細胞計数器を用いて細胞を数えます。 媒体は入口の両方で針から流出するまで鈍14 G針を有する1mLの注射器を使用して、化学勾配路の出口から無血清培地を注入します。化学勾配路の出口からの細胞懸濁液200μlを注入します。 細胞がマイクロ流体チャネルに導入されていることを確認するために顕微鏡下でデバイス内の細胞培養室を守ってください。湿度の高い容器（ 例えば、のddH 2 O内側にプラスチック製の箱）にデバイスを配置し、デバイス表面上に細胞の接着を促進するために5時間細胞培養インキュベーターに保管してください。 REAGの調製化学勾配の生成のためのエント無血清培地中で所望の濃度（100ng / mlの）で化学（SDF-1α）を準備します。高純度のチューブに接続された2つの別々の3ミリリットルシリンジに薬液でとすることなく、無血清培地を描画します。後で使用するために1μL/分の流量でシリンジポンプにシリンジを設定します。 酸素勾配の生成のための試薬の調製 1 M NaOH溶液の15ミリリットルと200 mg / mlでピロガロール溶液15mlを加えます。それぞれ、高純度のPTFEチューブと高純度のチューブに接続された2つの独立した15ミリリットルの注射器にNaOHおよびピロガロールソリューションを描画します。後で使用するために5μL/分の流量でシリンジポンプにシリンジを設定します。 マイクロ流体デバイスのセットアップ 5時間インキュベートした後、デバイス全体を取り出し、直径15cmのペトリ皿の上に置きます。接着剤パテを使用して、ペトリ皿にデバイスを修正しました。転送インキュベーターでのライブセルイメージング顕微鏡にペトリ皿。 化学勾配路の流入口に化学的勾配を生成するための注射器からチューブを接続します。廃棄物容器につながる配管にコンセントを接続します。化学勾配を生成するためのシリンジとシリンジポンプをオンにします。 酸素勾配路の流入口にNaOHを含むシリンジおよびピロガロールから高純度のチューブを接続します。廃棄物を収集するためにコンセントにチューブを接続します。酸素勾配を生成するためのシリンジとシリンジポンプをオンにします。 しっとりデバイスを維持するためにペトリ皿にのddH 2 Oの約15ミリリットルを追加します。時間経過画像キャプチャのためのライブセルイメージング顕微鏡を設定し、画像ごとに15分を取ります。 3日目：データ収集と分析 パソコンに取り込んだ画像ファイルを転送します。オープンソースの画像ANを使用して画像を分析alysisソフトウェア、マニュアルトラッキング（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html）のためのオープンソースのプラグインとフリー走化性ToolソフトウェアとImageJの、（http://ibidi.com/xtproducts / EN /ソフトウェア・アンド・画像解析/マニュアル-画像解析/走化性・アンド・マイグレーション・ツール）15、16。 グラデーションの3キャラクタリゼーション注：化学的酸素勾配は、細胞実験の前または後に特徴づけることができます。 化学勾配の数値シミュレーション 計算流体力学（CFD）シミュレーションを用いて、マイクロ流体の層流の性質を推定します。 酸素勾配の実験的特性評価 酸素感受性蛍光色素、トリス（2,2'-ビピリジル）ルテニウム（III）六水和物、5の濃度で水に溶液を調製しますミリグラム/ mlです。 高純度のチューブに接続された2つの別々の3ミリリットルシリンジ中に酸素感受性色素溶液を描画します。 （化学勾配の生成に使用される流量と同じ）1μL/分の流量でシリンジポンプにシリンジを設定します。 化学勾配チャネルの注入口に注射器からチューブを接続します。廃棄物容器につながる配管にコンセントを接続します。化学勾配を生成するためのシリンジとシリンジポンプをオンにします。 470±20nmの光フィルタを通過した励起光を倒立蛍光顕微鏡を用いて蛍光強度を測定します。クールCCDカメラを使用して515 nmのロングパス発光フィルターを通して発光を収集します。 酸素勾配路の流入口にNaOHを含むシリンジおよびピロガロールから高純度のチューブを接続します。廃棄物を収集するためにコンセントにチューブを接続します。酸素用シリンジとシリンジポンプをオンにします勾配の世代。 細胞培養チャンバ内を流れる酸素感受性色素の蛍光画像を収集します。 酸素勾配の生成のためのフローを停止し、酸素発生チャネルにすべてのチューブを外します。酸素勾配チャネルの出口にガスボンベから高純度のチューブを接続します。 酸素勾配路に接続されたチューブ内に空気、純窒素、純酸素を流したときに、細胞培養チャンバ内に流入する酸素感受性色素の蛍光画像を収集します。 参考文献10および11に記載のシュテルン – フォルマーの式を用いて蛍光画像を解析することにより、酸素の勾配を推定します。