Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Mikroakışkan Aygıt 1. Fabrikasyon NOT: Tüm mikroakışkan cihaz yumuşak litografi çoğaltma kalıplama işlemi 13 kullanılarak imal edilir. Mikroakışkan cihaz PDMS katmanları için kalıp imalatı mikroakışkan kanal desenleri piyasada mevcut illüstrasyon kullanarak veya çizim yazılımı tasarlayın. 14 baskı yüksek çözünürlüklü şeffaflık photomask için bir şirkete dosyayı gönderin. Aseton (≥99.5%), izopropil alkol ile temiz silikon gofret (IPA, ≥99.9%) ve etch tamponlu oksit (boe; 6: 1 NH4 F.HF). deiyonize (DI) su ile durulayın ve bir azot tabancası ile gofret kurutmak. Negatif sesi Fotorezist Spin kat yaklaşık 20 g, SU-8 2050, 15 saniye için 500 rpm'de gofret üzerine ve daha sonra 2,000 rpm'de 30 saniye için. NOT: spin kaplama koşulu SU-8 2050 fotoğraf vermelidiroptik litografi sonra yaklaşık 75 mikron gofret üzerinde bir kalınlığa sahip katmanları karşı. Yumuşak fırında 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerindeki gofret 3 dakika boyunca ve daha sonra 9 dakika süreyle 95 ° C de. Yumuşak fırında sonra, UV ışığı altında tasarlanmış şeffaflık maskeleri ile bir maske hizalama kullanarak gofret maruz; toplam maruz kalma enerjisi yaklaşık 300 mJ / cm 2 olmalıdır. Maruz kalma sonrası fırında (PEB) 65 ° C 'de gofret, 2 dakika ve daha sonra da 7 dakika süre ile 95 ° C' de. PEB sonra mutlaka çalkalama ile ya da ultrasonik banyosuna 7 dakika boyunca (37 kHz ve 180 W etkili bir ultrasonik güç) SU-8 geliştirici gofret bırakın. Kalan SU-8 kaldırmak için aseton ve IPA ile gofret durulayın. yonga ve silan 100 ul (1 H, 1 H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) istenmeyen yapışmayı önlemek için ince bisküvi yüzeyi silanizasyon bir diyaframlı vakum pompası ile bağlantılı bir desikatör içinde 6 cm çapında Petri kabı içine. , 15 dakika süreyle pompa açmak kapatmakVe 30 dakika boyunca bir vakum desikatörde mühür. desikatöre dışına Silanlanmış gofret alın ve aşağıdaki ekran litografi işlemi için 15 cm çapında Petri onları bant: İmalat ve PDMS tabakalarının takımı PDMS nin önceden polimerin hazırlanması 10 PDMS monomer (baz) ve sertleştirme ajanı karıştırın: 1 oranında (hac / hac). 60 dakika desiccator kurulumunda karışımı Degas. PC-gömülü üst tabakanın imalatı Üst tabaka akışkan kanal desenleri ile kalıp üzerine PDMS pre-polimer transferi 2 gr PDMS ince bir tabaka yapmak. 60 dakika boyunca gazının PDMS desiccator kurulumunda kalıp yerleştirin. PDMS kür için bir 60 ° C fırında kalıp gecede yerleştirin. Kalıp yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun. Oda sıcaklığına kadar kalıp serinleyin. kalıp üzerine PDMS nin önceden polimer ek bir 13 g dökün ve th PDMS şekilde gaz60 dakika için e desiccator kurulumu. Yavaş yavaş bir gaz difüzyon bariyeri olarak taze PDMS tabakası içine 1 mm kalınlığında PC filmi embed; Gerekirse kabarcıkları sınırdışı. 60 ° C fırında kalıp gecede koymak ve yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun. Oda sıcaklığına kadar tedavi PDMS serinleyin. Tüm kanal desenleri kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 cm 2 'lik bir alana, bir neşter cihazı kesti ve kalıp PDMS levha soyulabilir. 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak giriş ve çıkışları için delikler. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal üst PDMS-PC katmanı saklayın. alt PDMS tabakanın imalatı Alt tabaka için kalıp üzerine PDMS nin önceden polimerin 11 g dökün. 60 dakika boyunca gazdan arındırın PDMS desikatör içinde kalıp yerleştirin. PDMS tedavisi için bir 60 ° C fırın içinde, kalıp bir gece boyunca devam edin. yatay bir düzlemde olduğundan emin olun. th soğumasınıOda sıcaklığına kadar e PDMS. Tüm kanal desenleri kapak ve kalıp kapalı soyulması yaklaşık olarak 5,5 x 5 cm 2 'lik bir alana, cihazı kesin. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal alt PDMS katmanı saklayın. PDMS membran imalat Spin kat, yaklaşık 4 90 sn için, 100 rpm'de bir silanize boş gofret üzerine PDMS nin önceden g polimer ve daha sonra 4 saniye boyunca 3000 rpm. fırını içinde gece boyunca 60 ° C'de spin kaplı gofret fırında. cihazın montajı Fabrikasyon PDMS-PC üst tabaka ve yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir O 2 plazma yüzey işleme makinesinde spin kaplı PDMS membran ile gofret yerleştirin. 40 sn için O2 plazma B 90 PDMS yüzeylerin muamele. Sağ O 2 plazma yüzey tedaviden sonra PDMS membran üzerine üst katmanı bağlamak. gümrüklü katmanları üst üste bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve onları koymakbağlanmayı teşvik etmek için 60 ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır. Oda sıcaklığına tabakadan soğutun ve her kanal için kalıpları kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 cm2'lik bir alana, bir neşter ile üst katmana birleştirilmiş örtüyü kesmesi. silikon gofret bağlı bir yapı soyulabilir ve 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak kimyasal degrade kanal girişlerine ve çıkışında delikler. 40 sn için 90 W plazma kullanılarak PDMS yüzeyler etkinleştirmek için, bağ yüzeyleri yukarı bakacak şekilde, O 2 plazma yüzey işleme makinesinde membran bağlı üst tabaka ve fabrikasyon PDMS alt tabaka yerleştirin. yüzey işlemi hemen sonra bağlanması birlikte üst ve alt katmanları takın. tüm gümrüklü cihazın üstüne bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve fırın gecede 60 ° C koydu. fırın dışına tüm fabrikasyon cihazı alın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını. 2. mikroakışkan hücre gücü deneyi NOT: Bu yazıda örnek olarak yaygın olarak kullanılan bir hücre hattı, adenocarcinomic insan alveoler bazal epitel hücre (A549), ve bir kemokin, stromal hücre kaynaklı faktör (SDF-1α), kullanın. diğer hücrelere ve kemokin üzerinde çalışan araştırmacılar için, buna göre deneysel süreçler ayarlayın lütfen. Gün 0: Hücre hazırlığı Kültür DMEM F12 L-glutamin yerine,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti içeren tam büyüme ortamında A549 hücrelerinin hazır. % 0.25 tripsin-EDTA ile ayrışma ile alt kültür. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 140 x g'de ayrışmış hücreler santrifüj ile deneyler için hücre süspansiyonları hazırlanır. Mikroakışkan cihaz deneyler için, hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve tam 10 ml T75 şişesi içinde en az 1 x 10 6 hücre tohumBüyüme ortamı. Not: Tüm hücre kültürü prosesleri, bir 37 ° C ve% 5 CO2 atmosferi ile bir kuluçka gerçekleştirilir. 1. Gün: Cihaz hazırlığı O 2 plazma makinenin içine yerleştiriniz ve mikroakışkan kanal hidrofilik yüzeyler işlemek için 40 saniye boyunca 90 W O 2 plazma ile tedavi. Hemen yüzey işleminden sonra, doğrudan kimyasal degrade kanal girişlerindeki PDMS katman içine delikli 2 mm çaplı deliklere iğneler takarak iki 14 G künt iğne yükleyin. iğneler mikroakışkan kanallarını bloke etmediğinden emin olun. Künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile GKD 2 O 0.8 ml çizin. Su girişlerindeki hem iğnelerden akana kadar prizden kimyasal degrade kanala GKD 2 O enjekte edilir. Dulbecco ve # ile fibronektin stok seyreltilmesi ile 50 ug / ml fibronektin çözeltisi 1 ml hazırlanması39 s Fosfat-Tamponlu Tuzu (DPBS). Çözelti girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından fibronektin çözeltisi infüzyonu. bilinen bir hücre kültürü inkübatöründe tüm cihazın bir gece boyunca inkübe edilir. 2. Gün: Hücre tohumlama ve mikroskopi görüntüleme hücre tohumlama 0. günde yana kültürlenmiştir hücrelerden ortam aspire ve DPBS 5 mi 2 kez yıkama hücreleri. DPBS aspire tripsin-EDTA 2 ml ekleyin ve kap yüzeyinden hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübatör hücrelerin inkübe edin. şişeye hücreler ayrılmış ve çözelti içinde süspansiyona alınmış kadar bekleyin ve serumsuz ortam içinde 8 ml ekleyin (DMEM F12 +% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti). 15 ml konik bir tüp içine tüm sıvı transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 140 x g'de santrifüj o. </li> Santrifüjden sonra süpernatan aspire ve nihai hücre yoğunluğu 1 x 10 6 hücre / ml yapmak için serumsuz ortam, uygun bir miktarda ilave edin. Hemasitometre veya başka otomatik hücre sayım cihazı kullanarak hücre sayımı 1. Günden hazırlanan mikroakışkan cihaz çıkar. Orta girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından serumsuz ortam enjekte edilir. Kimyasal gradyan kanalın çıkışından hücre süspansiyonu 200 ul enjekte edilir. Hücreler mikroakışkan kanala girmiştir onaylamak için mikroskop altında cihazda hücre kültür odasının gözlemleyin. Nemli bir kap (örneğin, GKD 2 O içinde bir plastik kutu) içine Cihazı ve aygıt yüzeyi üzerine hücre yapışmasını sağlamak için 5 saat için bir hücre kültürü inkübatöründe tutun. Reaktifler hazırlanmasıKimyasal gradyan üretimi için hastalar Serum-barındırmayan ortam içinde istenen konsantrasyonda (100 ng / ml) kimyasal (SDF-1α) hazırlayın. ve yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara kimyasal içermeyen serumsuz ortam çizin. daha sonra kullanmak için 1 ul / dk'lık bir akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. Oksijen degrade üretimi için reaktiflerin hazırlanması 1 M NaOH çözeltisi 15 ml ve 200 mg / ml pirogalol çözelti 15 ml olun. sırasıyla yüksek saflıkta PTFE tüp ve yüksek saflıkta boru, bağlı iki ayrı 15 ml şırınga içine NaOH ve pirogallol çözümleri çizin. daha sonra kullanmak için 5 ul / dakika akış oranı ile bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. Mikroakışkan cihaz kurulumu 5 saat inkübasyondan sonra, tüm cihaz çıkar ve 15 cm çapında Petri kabı üzerine yerleştirin. yapışkan macun kullanılarak Petri kabındaki cihazı sabitleyin. TransferiBir inkübatör canlı hücre görüntüleme mikroskop Petri kabı. Kimyasal degrade kanal girişlerine kimyasal degrade nesil için şırınga hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. Nemli cihazı tutmak için Petri kabı GKD 2 O yaklaşık 15 ml ekleyin. zaman lapsed görüntü yakalamak için canlı hücre görüntüleme mikroskobu kurmak ve bir görüntüyü her 15 dakika sürer. 3. Gün: Veri toplama ve analizi Bir bilgisayara yakalanan görüntü dosyaları aktarın. açık kaynak kodlu bir görüntüsü, kullanarak görüntüleri analizalysis yazılım, ImageJ, Manuel İzleme için bir açık kaynak eklentisi (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) ve ücretsiz Kemotaksis Aracı yazılımı ile (http://ibidi.com/xtproducts / tr / Yazılım-ve-Görüntü-Analiz / Manuel Görüntü Analizi / Kemotaksis-ve-Göç-Aracı) 15, 16. Gradyanların 3. Karakterizasyonu NOT: Kimyasal ve oksijen eğimleri önce veya hücre deneyleri sonrasında karakterize edilebilir. Kimyasal degrade sayısal simülasyon hesaplamalı akışkan dinamiği (CFD) simülasyonu kullanarak Mikroakiskan laminar flow doğasını tahmin edin. Oksijen degrade Deneysel karakterizasyonu 5 konsantrasyonda bir oksijen duyarlı fluoresan boya, tris (2,2'-bipiridil) rutenyum (III) klorür heksahidrat, su içinde bir çözelti hazırlamakmg / ml olmuştur. yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara oksijene duyarlı boya çözeltisini çizin. (Kimyasal gradyan üretimi için kullanılan akış hızı ile aynı) 1 ul / dk akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. Kimyasal degrade kanal girişlerine şırıngalar hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. 470 ± 20 nm optik filtreden geçen uyarım ışığı ile bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak fluoresans şiddetini ölçmek. serin bir CCD kamera kullanılarak 515 nm uzun geçiş emisyon filtresi aracılığıyla emisyon ışığı toplamak. Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen için şırınga ile şırınga pompası açıngradyan nesil. hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın. Oksijen degrade üretimi için akışını durdurmak ve oksijen üretim kanalına tüm boru bağlantısını kesin. Oksijen degrade kanalın çıkışına gaz silindirleri yüksek saflıkta tüp bağlayın. Oksijen gradyanı kanala bağlı boru içine hava, saf azot ve saf oksijen akışı olduğunda hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın. Kaynaklar 10 ve 11, uygun olarak Stern-Volmer denklemi kullanılarak floresans görüntüleri analiz ederek oksijen gradyanlar tahmin.