Polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdische apparaten voor mobiele Migration Studies Onder Perpendicular Chemical en zuurstof verlopen

1. Fabricage van microfluïdische apparaat NB: De gehele microfluïdische apparaat wordt vervaardigd met behulp van de zachte lithografie replica gietproces 13. Vervaardiging van matrijzen voor de PDMS lagen in de microfluïdische inrichting Het ontwerp van de microfluïdische kanaal patronen met behulp van commercieel verkrijgbare illustratie of software te tekenen. Verzend het bestand naar een bedrijf voor hoge-resolutie transparantie photomask afdrukken 14. Schone silicium wafers met aceton (≥99.5%), isopropylalcohol (IPA; ≥99.9%), en gebufferde oxide ets (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Spoelen met gedeïoniseerd (DI) water en dehydrateren de wafer met stikstof pistool. Spin jas bij benadering 20 g negatieve toon fotolak, SU-8 2050, op de wafers bij 500 rpm voor 15 sec en dan 2000 rpm voor 30 sec. LET OP: De spin-coating voorwaarde moet SU-8 2050 foto opleverenresist lagen met een dikte van ongeveer 75 urn op de plakken na optische lithografie. Zacht bakken de wafels op 65 ° C verwarmingsplaat gedurende 3 minuten en vervolgens bij 95 ° C gedurende 9 min. Na de zachte bakken, bloot de wafers met behulp van een masker aligner met de ontworpen transparantie maskers onder UV-licht; de totale energie blootstellingstijd bedraagt ongeveer 300 mJ / cm2. Bakken na belichting (PEB) de wafers bij 65 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens bij 95 ° C gedurende 7 min. Na de PEB, dompel de wafers in SU-8 developer met sterke agitatie of in een ultrasoon bad (37 kHz en 180 W effectieve ultrasoon vermogen) gedurende 7 min. Spoel de wafer met aceton en IPA om de resterende SU-8 te verwijderen. Plaats de wafer en 100 pl silaan (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) in een 6 cm diameter Petrischaal in een exsiccator verbonden met een diafragma vacuümpomp wafeloppervlak silaneren teneinde ongewenste hechting te voorkomen. Zet de pomp gedurende 15 minuten, zet hem dan uit, En sluit de exsiccator met een vacuüm gedurende 30 min. Neem de gesilaniseerde wafers uit de exsiccator en plak ze tot 15 cm diameter Petrischalen voor de volgende soft lithografie-proces: Fabricage en assemblage van PDMS lagen Bereiding van het prepolymeer PDMS Meng PDMS monomeer (base) en verharder in een 10: 1 verhouding (v / v). Ontgas het mengsel in de exsiccator setup voor 60 min. Fabricage van de PC-ingebedde toplaag Overdracht 2 g PDMS prepolymeer op het matrijsoppervlak de toplaag fluïde kanaalrasters een dun laagje PDMS maken. Plaats de vorm in de exsiccator setup ontgassen de PDMS gedurende 60 min. Leg de mal 's nachts in een 60 ° C oven gedurende PDMS uitharden. Zorg ervoor dat de mal is op een horizontaal vlak. Koel de mal tot kamertemperatuur. Kap een extra 13 g PDMS prepolymeer op de mal en ontgas de PDMS in The exsiccator opstelling voor 60 min. Langzaam insluiten een 1 mm dikke PC film in de frisse PDMS laag als een gas diffusiebarrière; verdrijven eventuele luchtbellen indien nodig. Zet de mal 's nachts in de 60 ° C oven, en zorg ervoor dat het op een horizontaal vlak. Afkoelen de uitgeharde PDMS op kamertemperatuur. Snijd het apparaat met een scalpel om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, waarin alle kanalen patronen kunnen dekken, en trek het PDMS plaat uit de mal. Punch gaten voor in- en uitlaten met behulp van een 2 mm diameter biopsie punch. Bewaar de gefabriceerde top PDMS-PC layer afstand van ambient stof voor latere montage. Fabricage van de onderste laag PDMS Giet 11 g PDMS prepolymeer op het matrijsoppervlak van de onderste laag. Plaats de vorm in de exsiccator tot Degas de PDMS gedurende 60 min. Houd de mal 's nachts in een 60 ° C oven voor op het PDMS te genezen. Zorg ervoor dat het ligt op een horizontaal vlak. Afkoelen the PDMS tot kamertemperatuur. Snijd het apparaat om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, die betrekking hebben op alle kanalen patronen en afschilferen van de mal. Bewaar de gefabriceerde onderste PDMS laag weg van ambient stof voor latere montage. Fabricage van de PDMS membraan Spin jas ongeveer 4 g PDMS pre-polymeer op een gesilaniseerd lege wafer bij 100 rpm gedurende 90 sec en dan 3.000 toeren per minuut gedurende 4 sec. Bak de spin beklede wafer in een 60 ° C oven gedurende de nacht. Montage van het apparaat Plaats de gefabriceerde PDMS-PC toplaag en de wafer met roterend bedekken PDMS membraan in een O2 plasma oppervlaktebehandeling machine met de hechtvlakken naar boven. Behandel de PDMS oppervlakken met 90 W van O 2 plasma voor 40 sec. Binden de toplaag op de PDMS membraan direct na de O 2 plasma oppervlaktebehandeling. Plaats een gewicht (ongeveer 600 g) boven op de gehechte lagen en ze in een60 ° C oven gedurende de nacht om binding te bevorderen. Afkoelen de gehechte lagen tot kamertemperatuur en snijd het membraan gehecht aan de toplaag met een scalpel om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, waarbij alle kanalen patronen kunnen dekken. Schil van de gebonden structuur van het silicium wafer en punch gaten aan de in- en uitgang van de chemische gradiënt kanaal met behulp van een 2 mm diameter biopsie punch. Plaats het membraan gebonden toplaag en de gefabriceerde PDMS onderste laag in het O2 plasma oppervlaktebehandeling machine, de hechtvlakken naar boven, naar de PDMS oppervlakken met plasma bij 90 W gedurende 40 seconden geactiveerd. Bevestig de bovenste en onderste lagen aan elkaar te hechten direct na de oppervlaktebehandeling. Plaats een gewicht (ongeveer 600 g) boven op het gehele gebonden apparaat en het in een 60 ° C oven gedurende de nacht. Neem het hele vervaardigd apparaat uit de oven en afkoelen tot kamertemperatuur. 2. microfluïdische Cell Migratie Assay OPMERKING: In dit artikel gebruiken we een veel gebruikte cellijn, adenocarcinomic mens alveolaire basale epitheelcellen (A549) en een chemokine, stromale cellen afgeleide factor (SDF-1α), als voorbeelden. Voor onderzoekers werken aan andere cellen en chemokines, neem dan pas de experimentele processen. Dag 0: Cel voorbereiding Cultuur de voorraad van A549 cellen in compleet groeimedium DMEM F12 L-glutamine substituut, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) Antimicrob-antimycotische oplossing. Subcultuur door dissociatie met 0,25% trypsine-EDTA. Bereid celsuspensies voor de experimenten door centrifugeren gedissocieerde cellen bij 140 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Voor de microfluïdische apparaat experimenten tellen van de cellen met een hemocytometer en zaden ten minste 1 x 10 6 cellen in een T75 kolf met 10 ml compleetgroeimedium. Opmerking: Alle celkweek processen worden uitgevoerd in een incubator met 37 ° C en 5% CO2 atmosfeer. Dag 1: Apparaat voorbereiding Plaats het apparaat in de O2 plasma machine en behandelen met O2 plasma bij 90 W gedurende 40 seconden te maken de microfluïdische kanaal hydrofiele oppervlakken. Onmiddellijk na de oppervlaktebehandeling, installeert twee 14 G botte naalden door direct inbrengen van de naalden in de 2 mm diameter gaatjes in het PDMS laag op de chemische gradiënt kanaal inlaten. Zorg ervoor dat de naalden niet de microfluïdische kanalen blokkeren. Trek 0,8 ml van DDH 2 O met behulp van een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald. Spuit de DDH 2 O in de chemische gradiënt kanaal uit het stopcontact tot het water stroomt uit beide naalden op de inlaten. Bereid 1 ml van 50 ug / ml fibronectine oplossing door verdunning met fibronectine stock Dulbecco & #39; s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Giet het fibronectine oplossing uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal met een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald totdat de oplossing stroomt uit beide naalden op de inlaten. Incubeer de gehele inrichting 's nachts in een conventionele celkweek incubator. Dag 2: Cel zaaien en microscopie imaging cell seeding Zuig het medium van de cellen die gekweekt waren sinds dag 0 en was de cellen met 5 ml DPBS 2 keer. Zuig het DPBS, voeg 2 ml trypsine-EDTA en incubeer de cellen in de incubator gedurende 5 minuten om de cellen los te maken van de kolf oppervlak. Wacht tot de cellen worden losgemaakt en gesuspendeerd in de oplossing en voeg 8 ml serumvrij medium (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimycotische oplossing) aan de kolf. Overdracht van al de vloeistof in een 15 ml conische buis en centrifugeer in bij 140 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li> Zuig het supernatant na centrifugeren en voeg een geschikte hoeveelheid van het serum-vrij medium om de uiteindelijke celdichtheid maakt 1 x 10 6 cellen / ml. Haal de microfluïdische apparaat voorbereid op dag 1. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een andere automatische cel tellen instrument. Injecteer serumvrij medium uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal met een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald totdat het medium stroomt uit beide naalden op de inlaten. Injecteer 200 ui van de celsuspensie uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal. Neem de celkweekkamer in de inrichting onder een microscoop te bevestigen dat de cellen zijn ingevoerd om de microfluïdische kanaal. Plaats het apparaat in een vochtige houder (bijvoorbeeld een plastic doos met DDH 2 O binnen) en bewaar het in een celkweek incubator gedurende 5 uur om de hechting van de cellen te bevorderen op het oppervlak apparaat. Bereiding van Reagenten voor de chemische gradiënt generatie Bereid de chemische (SDF-1α) in de gewenste concentratie (100 ng / ml) in serumvrij medium. Teken de serumvrij medium met en zonder de chemische stof in twee afzonderlijke 3 ml spuiten verbonden hoogzuivere buizen. Stel de spuiten op een injectiespuit pomp met een stroomsnelheid van 1 pl / min voor later gebruik. Bereiding van de reagentia voor zuurstofgradiënt generatie Voeg 15 ml 1 M NaOH-oplossing en 15 ml van 200 mg / ml oplossing pyrogallol. Teken de NaOH en pyrogallol oplossingen in twee 15 ml spuiten verbonden hoogzuivere PTFE-buis en hoogzuiver buizen respectievelijk. Stel de spuiten op een injectiespuit pomp met debiet van 5 pl / min voor later gebruik. Microfluïdische setup apparaat Na 5 uur incubatie, neem het hele apparaat naar buiten en leg het op een 15 cm diameter petrischaal. Bevestig het apparaat in de petrischaal met behulp van lijm stopverf. Breng dePetrischaal naar een live-cell imaging microscoop in een couveuse. Sluit de slang van de spuiten voor de chemische gradiënt generatie op de inlaten van de chemische gradiënt kanaal. Sluit de uitlaat buis die leidt naar een afvalreservoir. Zet de spuit pomp met de spuiten voor chemische gradiënt generatie. Sluit de hoge zuiverheid slang van het spuiten met NaOH en pyrogallol aan de inlaten van de zuurstof gradiënt kanaal. Sluit de slang aan op de uitlaat om het afval te verzamelen. Zet de spuit pomp met de spuiten voor zuurstof gradiënt generatie. Voeg ongeveer 15 ml van DDH 2 O om de petrischaal om het apparaat gehydrateerd te houden. Stel de live-cell imaging microscoop voor tijd vervallen beeld vast te leggen, en neem een ​​beeld om de 15 min. Dag 3: Data verzameling en analyse Breng de opname bestanden naar een computer. Analyseren van de beelden met behulp van een open source-afbeelding van eenalysis software, ImageJ, met een open source plugin voor Manual Tracking (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) en een gratis Chemotaxis Tool (http://ibidi.com/xtproducts / nl / Software-en-Image-Analysis / Manual-Image-Analysis / Chemotaxis-and-Migration-Tool) 15, 16. 3. Karakterisering van de Verlopen NB: De chemische en zuurstof gradiënten kunnen worden gekarakteriseerd voor of na de celexperimenten. Numerieke simulatie van de chemische gradiënt Schat de laminaire stroming aard van microfluidics middel van computationele fluidic dynamics (CFD) simulatie. Karakterisatie van de zuurstofgradiënt Bereid een zuurstofgevoelige fluorescente kleurstof, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (III) chloride hexahydraat oplossing in water bij een concentratie van 5mg / ml. Teken de zuurstofgevoelige kleurstof oplossing in twee afzonderlijke 3 ml spuiten verbonden hoogzuivere buizen. Stel de spuiten op een injectiepomp met stroomsnelheid van 1 pl / min (identiek aan de stroomsnelheden voor de chemische gradiënt generatie). Sluit de slang van de spuiten aan de inlaten van de chemische gradiënt kanaal. Sluit de uitlaat buis die leidt naar een afvalreservoir. Zet de spuit pomp met de spuiten voor chemische gradiënt generatie. Meet de fluorescentie-intensiteit met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met excitatie licht door een 470 ± 20 nm optisch filter. Verzamel de emissie licht door een 515 nm lange-pass-emissie filter met behulp van een koele CCD-camera. Sluit de hoge zuiverheid slang van het spuiten met NaOH en pyrogallol aan de inlaten van de zuurstof gradiënt kanaal. Sluit de slang aan op de uitlaat om het afval te verzamelen. Schakel de spuitpomp met spuiten voor zuurstofgradiënt generatie. Verzamel de fluorescentie beelden van de zuurstofgevoelige kleurstof stroomt in de celkweek kamer. Stop de stroom aan zuurstof gradiënt generatie en koppel alle slangen om de zuurstof generatie kanaal. Verbinding hoge zuiverheid slang van de gasflessen met de uitlaat van de zuurstofgradiënt kanaal. Verzamel de fluorescentiebeelden van de zuurstofgevoelige kleurstof stroomt in de celkweekkamer als stromende lucht, zuivere stikstof, zuivere zuurstof en in de slang verbonden met de zuurstofgradiënt kanaal. Schat de zuurstof hellingen door het analyseren van de fluorescentie beelden met behulp van de Stern-Volmer vergelijking volgens Referenties 10 en 11.