Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

1. fabbricazione del dispositivo Microfluidic NOTA: L'intero dispositivo microfluidica è fabbricato utilizzando il morbido processo di stampaggio litografia replica 13. Fabbricazione di stampi per strati PDMS nel dispositivo microfluidico Progettare i modelli di canale microfluidica utilizzando disponibili in commercio illustrazione o il software di disegno. Inviare il file a una società per alta risoluzione trasparenza stampa 14 fotomaschere. Wafer di silicio Pulire con acetone (≥99.5%), alcol isopropilico (IPA; ≥99.9%) e di incisione ossido tamponato (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Risciacquare con acqua deionizzata (DI) e disidratare il wafer con una pistola di azoto. cappotto Spin approssimativo 20 g di photoresist tono negativo, SU-8 2050 sui wafer a 500 giri al minuto per 15 secondi e poi 2.000 rpm per 30 sec. NOTA: La condizione di spin coating dovrebbe produrre SU-8 2050 fotoresistere strati con uno spessore di circa 75 micron su wafer dopo litografia ottica. cuocere morbido i wafer su una piastra C 65 ° per 3 minuti e poi a 95 ° C per 9 min. Dopo la cottura morbida, esporre i wafer utilizzando un assetto maschera con le maschere di trasparenza destinati ai raggi UV; l'energia totale esposizione dovrebbe essere di circa 300 mJ / cm 2. bake post-esposizione (PEB) i wafer a 65 ° C per 2 minuti e poi a 95 ° C per 7 minuti. Dopo il PEB, immergere le cialde di SU-8 sviluppatore con forte agitazione o in un bagno a ultrasuoni (37 kHz e 180 W di potenza ultrasonica efficace) per 7 minuti. Lavare il wafer con acetone e IPA per rimuovere il residuo SU-8. Posizionare il wafer e 100 ml di silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) in un diametro di 6 cm Petri in un essiccatore collegato con una pompa a vuoto a membrana per wafer superficie silanizzazione per evitare l'incollaggio indesiderato. Accendere la pompa per 15 minuti, spegnerlo, E sigillare l'essiccatore con un vuoto per 30 min. Prendere le cialde silanizzati fuori dalla essiccatore e incollate a 15 cm di diametro piatti Petri per il seguente processo di litografia soffice: Fabbricazione e montaggio di strati PDMS Preparazione del PDMS pre-polimero Mescolare PDMS monomero (base) e l'agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (v / v). Degassare la miscela nella configurazione essiccatore per 60 min. Realizzazione dello strato superiore PC-embedded Trasferimento 2 g di PDMS pre-polimero sullo stampo con i modelli di canale fluidici alto livello per renderlo un sottile strato di PDMS. Mettere lo stampo nel setup essiccatore a Degas il PDMS per 60 min. Posizionare la notte stampo 60 ° C forno per PDMS polimerizzazione. Assicurarsi che lo stampo è su un piano orizzontale. Raffreddare lo stampo a temperatura ambiente. Versare un ulteriore 13 g di PDMS pre-polimero sullo stampo e degassarla PDMS in thinstallazione di essiccatore e per 60 min. Lentamente incorporare a 1 mm film PC spessore nello strato PDMS fresco come una barriera di diffusione di gas; espellere eventuali bolle se necessario. Mettere la notte muffa in C forno a 60 °, e assicurarsi che sia su un piano orizzontale. Raffreddare il PDMS curate a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale, e staccare la lastra PDMS dallo stampo. Punch fori per ingressi e le uscite con 2 mm di diametro biopsia pugno. Conservare lo strato PDMS-PC top fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito. Realizzazione dello strato inferiore PDMS Versare 11 g di PDMS pre-polimero sullo stampo per lo strato inferiore. Mettere lo stampo in un essiccatore a Degas il PDMS per 60 min. Mantenere la notte dello stampo in forno a 60 ° per curare il PDMS. Assicurarsi che è sdraiata su un piano orizzontale. Raffreddare °e PDMS a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo ad una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale, e sfilarlo dello stampo. Conservare lo strato PDMS fondo fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito. Realizzazione della membrana PDMS cappotto Spin circa 4 g di PDMS pre-polimero su un wafer di vuoto silanizzata a 100 rpm per 90 secondi e poi 3.000 rpm per 4 sec. Cuocere il wafer spin-rivestito in un forno a 60 ° C durante la notte. Assemblaggio del dispositivo Posizionare lo strato superiore PDMS-PC fabbricato e il wafer con la membrana PDMS spin-rivestito in una macchina di trattamento di superficie al plasma 2 O con le superfici di incollaggio rivolto verso l'alto. Trattare le superfici PDMS con 90 W di O 2 plasma per 40 sec. Incollare lo strato superiore sulla membrana PDMS subito dopo il trattamento superficiale al plasma O 2. Mettere un peso (circa 600 g) sulla parte superiore degli strati legati e metterli in un60 ° C overnight forno per promuovere bonding. Raffreddare i strati incollati a temperatura ambiente e tagliare la membrana legato allo strato superiore con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale. Staccare la struttura legato dal wafer di silicio e perforare agli ingressi e uscita del canale sfumatura chimica utilizzando a 2 mm di diametro biopsia punch. Posizionare lo strato superiore della membrana-legato e lo strato inferiore PDMS fabbricate in O macchina di trattamento di superficie al plasma 2, con le superfici di incollaggio rivolto verso l'alto, per attivare le superfici PDMS utilizzando il plasma a 90 W per 40 sec. Attaccare gli strati superiore e inferiore insieme per incollaggio immediatamente dopo il trattamento di superficie. Mettere un peso (circa 600 g) sopra l'intero dispositivo di incollaggio e metterlo in un forno a 60 ° C durante la notte. Prendere l'intero dispositivo fabbricato dal forno e raffreddare a temperatura ambiente. 2. Assay Migrazione cellulare Microfluidic NOTA: In questo lavoro, si usa una linea cellulare di uso comune, adenocarcinomic alveolari cellule epiteliali basali umano (A549), e una chemochina, fattore delle cellule stromali derivate (SDF-1α), come esempi. Per i ricercatori che lavorano su altre cellule e chemochine, regolare i processi sperimentali di conseguenza. Giorno 0: preparazione delle cellule Cultura lo stock di cellule A549 in terreno di coltura completo contenente DMEM F12 L-glutammina sostituto, il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), e 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico. Sub-cultura per dissociazione con 0,25% tripsina-EDTA. Preparare sospensioni cellulari per gli esperimenti mediante centrifugazione cellule dissociate a 140 xg per 3 min a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di dispositivi microfluidici, contare le cellule utilizzando un emocitometro e seme di almeno 1 x 10 6 cellule in un pallone T75 con 10 ml di completoterreno di coltura. NOTA: Tutti i processi di coltura cellulare vengono eseguite in un incubatore con 37 ° C e 5% CO 2 nell'atmosfera. Giorno 1: preparazione Dispositivo Posizionare il dispositivo nella macchina del plasma O 2 e trattarlo con O 2 al plasma a 90 W per 40 secondi per rendere il canale microfluidica superfici idrofile. Immediatamente dopo il trattamento superficiale, installare due 14 aghi smussati G inserendo direttamente gli aghi nei fori del diametro di 2 mm punzonate nello strato PDMS alle bocche canale gradiente chimico. Assicurarsi che gli aghi non bloccano i canali microfluidica. Disegnare 0,8 ml di DDH 2 O utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G. Iniettare il DDH 2 O nel canale gradiente di chimica dalla presa fino a quando l'acqua fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche. Preparare 1 ml di soluzione di fibronectina 50 mg / ml diluendo fibronectina magazzino con Dulbecco & #39; s fosfato-Buffered Saline (DPBS). Infondere la soluzione fibronectina dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché la soluzione fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche. Incubare tutta la notte in un dispositivo convenzionale incubatore di coltura cellulare. Giorno 2: Cell semina e la microscopia di imaging cellulare semina Aspirare il mezzo dalle cellule che sono state coltivate dal giorno 0 e lavare le cellule con 5 ml di DPBS 2 volte. Aspirare il DPBS, aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA e incubare le cellule in incubatore per 5 minuti per staccare le cellule dalla superficie matraccio. Attendere finché le cellule vengono staccate e sospese nella soluzione e aggiungere 8 ml di mezzo privo di siero (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico soluzione) al pallone. Trasferire tutto il liquido in un tubo da 15 ml e centrifugare a 140 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione ed aggiungere una quantità appropriata di mezzo privo di siero per rendere la densità cellulare finale 1 x 10 6 cellule / ml. Estrarre il dispositivo a microfluidi preparato il giorno 1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o di un altro strumento automatico conteggio delle cellule. Iniettare mezzo privo di siero dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché il fluido scorre da entrambi gli aghi alle bocche. Iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare dalla presa del canale sfumatura chimica. Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule sono state introdotte al canale microfluidica. Posizionare il dispositivo in un contenitore umido (ad esempio, una scatola di plastica con DDH 2 O all'interno) e tenerlo in un incubatore di coltura cellulare per 5 ore per promuovere l'adesione delle cellule sulla superficie periferica. Preparazione di REAGEnt per la generazione di gradiente chimico Preparare la chimica (SDF-1α) alla concentrazione desiderata (100 ng / ml) in mezzo privo di siero. Disegnare il terreno privo di siero con e senza la chimica in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min per un uso successivo. Preparazione dei reagenti per la generazione di ossigeno gradiente Rendere 15 ml di soluzione 1 M di NaOH e 15 ml di 200 mg / ml soluzione pirogallolo. Disegnare il NaOH e soluzioni pirogallolo in due separati 15 ml siringhe collegate a elevata purezza tubi in PTFE e tubi di grande purezza, rispettivamente. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 5 ml / min per un uso successivo. configurazione del dispositivo microfluidica Dopo l'incubazione 5 ore, prendere l'intero dispositivo fuori e metterlo su un 15 cm di diametro Petri. Fissare il dispositivo nella scatola di Petri con stucco adesivo. trasferire ilCapsula di Petri per un live microscopio imaging cellulare in un incubatore. Collegare il tubo dalle siringhe per la generazione del gradiente chimica agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l'uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico. Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno. Aggiungere circa 15 ml di DDH 2 O per la piastra di Petri per mantenere il dispositivo idratata. Impostare il microscopio imaging cellulare dal vivo per la cattura di immagini e ritardi, e scattare una foto ogni 15 min. 3 ° giorno: la raccolta e l'analisi dei dati Trasferire i file immagine catturati a un computer. Analizzare le immagini utilizzando l'immagine di un open sourcesoftware ANALISI, ImageJ, con un plugin open source per Allineamento manuale (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) e un software gratuito Chemiotassi Tool (http://ibidi.com/xtproducts / it / software-and-Immagine-Analysis / Manual-Immagine-Analysis / chemiotassi-e-migrazione-Tool) 15, 16. 3. Caratterizzazione dei gradienti NOTA: I gradienti chimici e ossigeno possono essere caratterizzati prima o dopo gli esperimenti cellulari. Simulazione numerica del gradiente chimico Stimare la natura flusso laminare di microfluidica utilizzando computazionali dinamiche fluidici simulazione (CFD). Caratterizzazione sperimentale del gradiente dell'ossigeno Preparare un colorante sensibile all'ossigeno fluorescente, tris (2,2'-bipiridile) di rutenio (III) cloruro esaidrato, soluzione in acqua ad una concentrazione di 5mg / ml. Disegnare la soluzione colorante sensibile all'ossigeno in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min (identici ai flussi utilizzati per la generazione del gradiente chimica). Collegare il tubo dalle siringhe agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l'uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico. Misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con la luce di eccitazione che passa attraverso un 470 ± 20 nm filtro ottico. Raccogliere l'emissione di luce attraverso un filtro passa-emissione lunga 515 nm utilizzando una fotocamera CCD fresco. Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per l'ossigenogenerazione di gradiente. Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all'ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare. Arrestare il flusso per la generazione di gradienti di ossigeno e scollegare tutte le tubazioni al canale generazione di ossigeno. Collegare il tubo di elevata purezza dalle bombole di gas all'uscita del canale gradiente di ossigeno. Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all'ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare quando scorre l'aria, azoto puro, e ossigeno puro nel tubo collegato al canale del gradiente di ossigeno. Stimare i gradienti di ossigeno analizzando le immagini di fluorescenza utilizzando l'equazione di Stern-Volmer in base alle referenze 10 e 11.