Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

1. La fabricación del dispositivo de microfluidos NOTA: Todo el dispositivo de microfluidos se fabrica mediante el proceso de moldeo de litografía blanda réplica de 13. Fabrication de moldes para la capas PDMS en la dispositivo de microfluidos Diseñar los patrones de los canales de microfluidos utilizando comercialmente disponible ilustración o el software de dibujo. Enviar el archivo a una empresa de alta resolución de la transparencia fotomáscara imprimir 14. Obleas de silicio limpio con acetona (≥99.5%), alcohol isopropílico (IPA; ≥99.9%), y grabado de óxido tamponado (BOE; 6: 1 NH4 F.HF). Enjuague con agua desionizada (DI) y deshidratar la oblea con una pistola de nitrógeno. capa de la vuelta aproximada 20 g de resina fotosensible tono negativo, SU-8 2050, sobre las obleas a 500 rpm durante 15 seg y luego 2.000 rpm durante 30 seg. NOTA: La condición de recubrimiento por rotación debe ceder SU-8 2050 fotoresistir capas con un espesor de aproximadamente 75 micras en las obleas después de la litografía óptica. hornear suave las obleas sobre una placa de cocción de 65 ° C durante 3 minutos y luego a 95 ° C durante 9 minutos. Después de la cocción suave, exponer las obleas utilizando un alineador de máscara con las máscaras de transparencia diseñados bajo luz UV; la energía total de exposición debe ser de aproximadamente 300 mJ / cm 2. bake post-exposición (PEB) las obleas a 65 ° C durante 2 min y luego a 95 ° C durante 7 min. Después de la PEB, sumergir las obleas en SU-8 desarrollador con fuerte agitación o en un baño de ultrasonidos (37 kHz y 180 W de potencia ultrasónica eficaz) para 7 min. Enjuague la oblea con acetona e IPA para eliminar el residuo de SU-8. Coloque la oblea y 100 l de silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) en un diámetro del plato 6 cm Petri en un desecador conectado con una bomba de vacío de diafragma de oblea superficie silanización con el fin de evitar la unión no deseada. Encienda la bomba durante 15 minutos, apagarloY sellar el desecador con un vacío durante 30 minutos. Tomar las obleas silanizados fuera del desecador y pegarlas a 15 cm de diámetro platos de Petri para el siguiente proceso de litografía blanda: Fabricación y montaje de capas PDMS Preparación de la pre-polímero PDMS Mezcla de monómeros PDMS (base) y el agente de curado en una relación de 10: 1 (v / v). Desgasificar la mezcla en la configuración desecador durante 60 min. La fabricación de la capa superior de PC embebido Transferencia de 2 g de los PDMS pre-polímero sobre el molde con los patrones de canal fluídico de la capa superior para hacer una fina capa de PDMS. Colocar el molde en la configuración desecador para desgasificar el PDMS durante 60 minutos. Coloque la noche a la mañana molde en un horno a 60 ° de PDMS curado. Asegúrese de que el molde está en un plano horizontal. Enfriar el molde a temperatura ambiente. Verter un 13 g más de PDMS pre-polímero sobre el molde y desgasificar el PDMS en THconfiguración e desecador durante 60 minutos. Lentamente incrustar una película de PC de espesor 1 mm en la capa de PDMS fresco como una barrera de difusión de gas; expulsar cualquier burbuja de si es necesario. Poner el molde durante la noche en el horno a 60 ° C, y asegúrese de que está en un plano horizontal. Enfriar el PDMS curado a temperatura ambiente. Cortar el dispositivo con un bisturí para una superficie aproximada de 5,5 x 5 cm 2, que puede cubrir todos los patrones de canal, y se desprenda la losa PDMS del molde. Hacer agujeros para entradas y salidas utilizando un punzón de biopsia de 2 mm de diámetro. Almacenar la capa de PDMS-PC superior fabricada lejos del polvo ambiental para el montaje posterior. La fabricación de la capa de PDMS inferior Verter 11 g de la pre-polímero PDMS sobre el molde para la capa inferior. Colocar el molde en el desecador para desgasificar el PDMS durante 60 minutos. Mantenga la noche a la mañana molde en un horno de 60 ° C para curar los PDMS. Asegúrese de que se ha quedado en un plano horizontal. Enfriar THe PDMS a temperatura ambiente. Cortar el dispositivo a una superficie aproximada de 5,5 x 5 cm 2, que puede cubrir todos los patrones de canal, y despegarlo del molde. Almacenar la capa de PDMS inferior fabricada lejos del polvo ambiental para el montaje posterior. La fabricación de la membrana de PDMS capa de la vuelta aproximada 4 g de PDMS pre-polímero sobre una oblea en blanco silanizada a 100 rpm durante 90 seg y luego 3.000 rpm durante 4 s. Hornear la oblea spin-revestido en un horno a 60 ° C durante la noche. Montaje del dispositivo Coloque la capa superior de PDMS-PC fabricado y la oblea con la membrana de PDMS mediante revestimiento por centrifugación en una máquina de tratamiento de superficie de plasma 2 O con las superficies de unión hacia arriba. El tratamiento de las superficies de PDMS con 90 W de plasma de O2 durante 40 segundos. Unir la capa superior sobre la membrana de PDMS justo después del tratamiento superficial de plasma de O2. Coloque un peso (aproximadamente 600 g) en la parte superior de las capas unidas y ponerlos en una60 ° C durante la noche horno para promover la unión. Enfriar las capas unidas a temperatura ambiente y cortar la membrana unida a la capa superior con un bisturí a un área de aproximadamente 5,5 x 5 cm 2, que puede cubrir todos los patrones de canal. Despegar la estructura unida de la oblea de silicio y perforar agujeros en las entradas y la salida del canal de gradiente químico usando un punzón de biopsia de 2 mm de diámetro. Coloque la capa superior de la membrana unidos y la capa inferior PDMS fabricadas en la máquina de tratamiento de superficies 2 plasma O, con las superficies de unión hacia arriba, para activar las superficies de PDMS utilizando el plasma a 90 W durante 40 segundos. Una las capas superior e inferior juntos para unir inmediatamente después del tratamiento de superficie. Coloque un peso (aproximadamente 600 g) en la parte superior de todo el dispositivo de servidumbre y lo puso en un horno a 60 ° C durante la noche. Tome todo el dispositivo fabricado fuera del horno y enfriar a temperatura ambiente. 2. Ensayo de migración de células de microfluidos NOTA: En este documento, usamos una línea celular de uso común, adenocarcinomic alveolar de células epiteliales basales humano (A549), y una quimiocina, factor de células del estroma derivadas (SDF-1α), como ejemplos. Para los investigadores que trabajan en otras células y quimiocinas, por favor, ajuste los procesos experimentales en consecuencia. Día 0: Preparación de las células Cultura el stock de las células A549 en medio de crecimiento completo que contiene DMEM F12 sustituto de L-glutamina, 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de solución Antimicrob-antimicótico. Sub-cultivo mediante disociación con 0,25% de tripsina-EDTA. Preparar suspensiones de células para los experimentos mediante la centrifugación de células disociadas a 140 xg durante 3 min a temperatura ambiente. Para los experimentos de dispositivos de microfluidos, contar las células usando un hemocitómetro y la semilla al menos 1 x 10 6 células en un matraz T75 con 10 ml de completamedio de crecimiento. NOTA: Todos los procesos de cultivo de células se llevan a cabo en un incubador con un 37 ° C y 5% de CO2. Día 1: Preparación de dispositivos Coloque el dispositivo en la máquina de plasma O 2 y tratarlo con plasma de O2 a 90 W durante 40 segundos para hacer que el canal de microfluidos superficies hidrófilas. Inmediatamente después del tratamiento de superficie, instalar dos 14 agujas romas G insertando directamente las agujas en los agujeros de diámetro 2 mm perforados en la capa de PDMS en las entradas de los canales de gradiente químico. Asegúrese de que las agujas no bloquean los canales de microfluidos. Dibuje 0,8 ml de ddH2O utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 14 G romo. Se inyecta la ddH2O en el canal de gradiente químico de la toma hasta que el agua fluye hacia fuera de ambas agujas en las entradas. Preparar 1 ml de la solución de fibronectina 50 mg / ml por dilución de fibronectina de valores con Dulbecco & #39; s tamponada con fosfato salino (DPBS). Infundir la solución de fibronectina de la salida del canal de gradiente químico utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 14 G romo hasta que la solución fluye hacia fuera de ambas agujas en las entradas. Incubar toda la noche a la mañana dispositivo en una incubadora de cultivo celular convencional. Día 2: la siembra de células y de imágenes de microscopía la siembra de células Aspirar el medio de las células que se cultivaron desde días 0 y lavar las células con 5 ml de DPBS 2 veces. Aspirar el DPBS, añadir 2 ml de tripsina-EDTA, y se incuban las células en la incubadora durante 5 min para separar las células de la superficie del matraz. Esperar hasta que las células se separan y se suspenden en la solución y añadir 8 ml de medio libre de suero (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicótico solución) al matraz. Transferir todo el líquido en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar al 140 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li> Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación y añadir una cantidad apropiada del medio libre de suero para hacer que la densidad celular final de 1 x 10 6 células / ml. Sacar el dispositivo de microfluidos preparado el día 1. Contar las células utilizando un hemocitómetro u otro instrumento automático de recuento celular. Inyectar medio libre de suero a partir de la salida del canal de gradiente químico utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 14 G romo hasta que el medio fluye hacia fuera de ambas agujas en las entradas. Inyectar 200 l de la suspensión de células a partir de la salida del canal de gradiente químico. Observar la cámara de cultivo celular en el dispositivo bajo un microscopio para confirmar que las células se han introducido en el canal de microfluidos. Coloque el dispositivo en un recipiente húmedo (por ejemplo, una caja de plástico con ddH2O en el interior) y mantenerlo en una incubadora de cultivo celular durante 5 horas para promover la adhesión de las células sobre la superficie del dispositivo. Preparación de reagpadres para la generación de gradiente químico Preparar el producto químico (SDF-1α) a la concentración deseada (100 ng / ml) en medio libre de suero. Dibuje el medio libre de suero con y sin el producto químico en dos separadas 3 ml jeringas conectadas a la tubería de alta pureza. Configurar las jeringas en una bomba de jeringa con un caudal de 1 l / min para un uso posterior. Preparación de los reactivos para la generación de gradiente de oxígeno Hacer 15 ml de solución de NaOH 1 M y 15 ml de 200 mg / ml de pirogalol solución. Dibuje el NaOH y soluciones de pirogalol en dos separadas 15 ml jeringas conectadas a alta pureza tubo de PTFE y el tubo de alta pureza, respectivamente. Configurar las jeringas en una bomba de jeringa con un caudal de 5 l / min para un uso posterior. configuración del dispositivo de microfluidos Después de la incubación de 5 horas, se llevará a cabo todo el dispositivo y colocarlo en un plato de 15 cm de diámetro Petri. Fijar el dispositivo en la placa de Petri utilizando masilla adhesiva. la transferencia de laplaca de Petri con un microscopio de imágenes de células vivas en una incubadora. Conectar el tubo de las jeringas para la generación gradiente químico a las entradas del canal de gradiente químico. Conectar la salida a un tubo que conduce a un depósito de residuos. Encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación de gradiente químico. Conectar el tubo de alta pureza a partir de las jeringas que contienen NaOH y pirogalol a las entradas del canal de gradiente de oxígeno. Conecte el tubo a la salida para recoger los residuos. Encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación de oxígeno gradiente. Añadir aproximadamente 15 ml de ddH 2 O a la placa de Petri para mantener el dispositivo hidratada. Configurar el microscopio imágenes de células vivas para la captura de imágenes en tiempo-caducado, y tomar una imagen cada 15 minutos. Día 3: recopilación y análisis de datos La transferencia de los archivos de imágenes capturadas a un ordenador. Analizar las imágenes usando una imagen de código abiertosoftware de estudio de carácter, ImageJ, con un plugin de código abierto para el seguimiento manual (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) y una herramienta de software libre quimiotaxis (http://ibidi.com/xtproducts / es / Software-y-imagen-Análisis / Manual-imagen-Análisis / quimiotaxis-y-Migration-Tool) 15, 16. 3. Caracterización de los gradientes NOTA: Los gradientes químicos y oxígeno pueden caracterizarse antes o después de los experimentos de células. Simulación numérica del gradiente químico Estimar la naturaleza de flujo laminar de microfluidos utilizando la dinámica de fluidos computacional de simulación (CFD). Caracterización experimental del gradiente de oxígeno Preparar un colorante fluorescente sensible al oxígeno, tris (2,2'-bipiridilo) rutenio (III) cloruro hexahidrato, solución en agua a una concentración de 5mg / ml. Dibuje la solución colorante sensible al oxígeno en dos jeringas de 3 ml separados conectados a la tubería de alta pureza. Configurar las jeringas en una bomba de jeringa con un caudal de 1 l / min (idéntica a las velocidades de flujo utilizadas para la generación gradiente químico). Conectar el tubo de las jeringas a las entradas del canal de gradiente químico. Conectar la salida a un tubo que conduce a un depósito de residuos. Encienda la bomba de jeringa con las jeringas para la generación de gradiente químico. Medir la intensidad de fluorescencia usando un microscopio de fluorescencia invertida con la luz de excitación que pasa a través de un filtro óptico nm 470 ± 20. Recoge la luz de emisión a través de un filtro de emisión de paso largo de 515 nm utilizando una cámara CCD fría. Conectar el tubo de alta pureza a partir de las jeringas que contienen NaOH y pirogalol a las entradas del canal de gradiente de oxígeno. Conecte el tubo a la salida para recoger los residuos. Encienda la bomba de jeringa con las jeringas de oxígenogeneración del gradiente. Recoger las imágenes de fluorescencia del colorante sensible al oxígeno que fluye en la cámara de cultivo celular. Detener el flujo de generación de gradiente de oxígeno y desconecte todos los tubos en el canal de generación de oxígeno. Conectar los tubos de alta pureza a partir de los cilindros de gas a la salida del canal de gradiente de oxígeno. Recoger las imágenes de fluorescencia del colorante sensible al oxígeno que fluye en la cámara de cultivo celular cuando fluye aire, nitrógeno puro y oxígeno puro en el tubo conectado al canal de gradiente de oxígeno. Estimar los gradientes de oxígeno mediante el análisis de las imágenes de fluorescencia usando la ecuación de Stern-Volmer según las referencias 10 y 11.