Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d'oxygène

1. Fabrication du dispositif microfluidique NOTE: L'ensemble du dispositif microfluidique est fabriqué en utilisant le procédé de moulage lithographie réplique douce 13. Fabrication de moules pour les couches PDMS dans le dispositif microfluidique Concevoir des modèles de canaux microfluidiques utilisant commercialement disponibles illustration ou logiciel de dessin. Soumettre le dossier à une société à haute résolution transparence photomasque impression 14. Wafers propres de silicium avec de l' acétone (≥99.5%), l' alcool isopropylique (IPA; ≥99.9%) et gravure d'oxyde tamponné (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Rincer à l'eau désionisée (DI) et déshydrater la plaquette avec un pistolet d'azote. manteau de Spin environ 20 g de ton négatif photoresist, SU-8 2050, sur les plaquettes à 500 tours par minute pendant 15 secondes, puis 2.000 tours par minute pendant 30 secondes. NOTE: La condition de revêtement par centrifugation devrait donner SU-8 2050 photorésister à des couches ayant une épaisseur d'environ 75 um sur les plaquettes après la lithographie optique. cuire au four doux les gaufrettes sur une C plaque 65 ° pendant 3 min, puis à 95 ° C pendant 9 min. Après la cuisson douce, exposer les plaquettes en utilisant un aligneur de masque avec les masques de transparence conçus sous la lumière UV; l'énergie d'exposition totale devrait être d' environ 300 mJ / cm 2. cuisson post-exposition (PEB) les plaquettes à 65 ° C pendant 2 min, puis à 95 ° C pendant 7 min. Après la PEB, plonger les tranches dans SU-8 développeur avec une forte agitation ou dans un bain à ultrasons (37 kHz et 180 W de puissance ultrasonore utile) pendant 7 min. Rincer la tranche avec de l'acétone et de l'IPA pour enlever le SU-8 résiduel. Placer la plaquette et 100 ul de silane (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) dans un plat de diamètre 6 cm de Pétri dans un dessiccateur relié à une pompe à vide à membrane pour la tranche de surface silanisation afin d'éviter le collage indésirable. Mettez la pompe pendant 15 minutes, éteignezEt sceller le dessicateur à vide pendant 30 min. Prenez les plaquettes silanisées du dessiccateur et les scotcher à 15 cm de diamètre plats de Pétri pour le processus de lithographie douce qui suit: Fabrication et assemblage de couches PDMS Préparation du pré-polymère PDMS Mélanger PDMS monomère (base) et l'agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 (v / v). Dégazer le mélange dans la configuration de dessicateur pendant 60 min. Fabrication de la couche supérieure PC-embedded Transfert 2 g du PDMS pré-polymère sur le moule avec les modèles de canaux fluidiques couche supérieure pour faire une fine couche de PDMS. Placer le moule dans la configuration du dessiccateur pour dégazer les PDMS pendant 60 min. Placez la nuit de moule dans un four à 60 ° pour PDMS durcissement. Assurez-vous que le moule est sur un plan horizontal. Refroidir le moule à la température ambiante. Versez un 13 g supplémentaire de PDMS pré-polymère sur le moule et dégazer les PDMS dans ee configuration de dessiccateur pendant 60 min. Incorporer lentement un film PC 1 mm d'épaisseur dans la couche fraîche de PDMS comme une barrière de diffusion gazeuse; expulser les bulles si nécessaire. Mettez la nuit de la moisissure dans la 60 ° C four, et assurez-vous que ce soit sur un plan horizontal. Refroidir les PDMS durcis à la température ambiante. Couper l'appareil avec un scalpel pour une superficie d'environ 5,5 x 5 cm 2, qui peut couvrir tous les modèles de canal, et de décoller la dalle PDMS du moule. Percez des trous pour les entrées et sorties en utilisant une biopsie poinçon 2 mm de diamètre. Rangez la couche supérieure PDMS-PC fabriqués loin de la poussière ambiante pour le montage ultérieur. Fabrication de la couche inférieure PDMS Verser 11 g de la pré-polymère PDMS sur le moule pour la couche inférieure. Placer le moule dans le dessicateur pour dégazer le PDMS pendant 60 min. Gardez la nuit de moule dans un four à 60 ° pour guérir les PDMS. Assurez-vous qu'il est couché sur un plan horizontal. Refroidir ee PDMS à la température ambiante. Couper l'appareil à une surface d'environ 5,5 x 5 cm 2, qui peut couvrir tous les modèles de canal, et le retirer du moule. Rangez la couche inférieure de PDMS fabriqués loin de la poussière ambiante pour le montage ultérieur. La fabrication de la membrane PDMS manteau de Spin environ 4 g de PDMS pré-polymère sur une plaquette vierge silanisé à 100 rpm pendant 90 secondes, puis 3000 tours par minute pendant 4 sec. Cuire la tranche de spin-revêtu d'une C 60 ° four pendant la nuit. Assemblée du dispositif Placer la couche supérieure PDMS-PC et la plaquette fabriquée avec la membrane PDMS déposée par centrifugation dans un plasma O 2 machine de traitement de surface avec des surfaces de liaison vers le haut. Traiter les surfaces PDMS avec 90 W de plasma O 2 pendant 40 secondes. Bond la couche supérieure sur la membrane PDMS juste après le traitement O 2 de surface par plasma. Placez un poids (environ 600 g) au-dessus des couches liées et les mettre dans un60 ° C pendant la nuit du four pour favoriser la liaison. Refroidir les couches liées à la température ambiante et couper la membrane liée à la couche supérieure avec un scalpel pour une superficie d'environ 5,5 x 5 cm 2, qui peut couvrir tous les modèles de canal. Décoller la structure collée de la plaquette de silicium et percer des trous au niveau des orifices d'entrée et de sortie du canal de gradient chimique en utilisant un poinçon de biopsie de 2 mm de diamètre. Placer la couche supérieure de membrane collée et la couche inférieure PDMS fabriqués dans le plasma O 2 machine de traitement de surface, les surfaces de liaison vers le haut, pour activer les surfaces PDMS en utilisant le plasma à 90 W pendant 40 secondes. Fixer les couches supérieure et inférieure ensemble pour lier immédiatement après le traitement de surface. Placez un poids (environ 600 g) sur le dessus de l'appareil lié ensemble et le mettre dans un C 60 ° four pendant la nuit. Prenez le dispositif fabriqué toute la sortie du four et laisser refroidir à température ambiante. 2. microfluidique Assay migration cellulaire NOTE: Dans cet article, nous utilisons une ligne couramment utilisée cellulaire, cellule adenocarcinomic humaine alvéolaire épithéliale basale (A549), et une chimiokine, le facteur cellules stromales dérivées (SDF-1α), à titre d'exemples. Pour les chercheurs travaillant sur d'autres cellules et les chimiokines, s'il vous plaît ajuster les processus expérimentaux en conséquence. Jour 0: Préparation de cellules Culture du stock de cellules A549 en milieu de croissance complet contenant DMEM F12 L-glutamine substitut, 10% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS), et 1% (v / v) solution Antimicrob-antimycosique. Sous-culture par dissociation avec 0,25% de trypsine-EDTA. Préparer des suspensions de cellules pour les expériences en centrifugeant les cellules dissociées à 140 x g pendant 3 min à température ambiante. Pour les expériences de dispositif microfluidique, compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la graine d' au moins 1 x 10 6 cellules dans un flacon T75 avec 10 ml d'completun milieu de croissance. Remarque: Tous les processus de culture de cellules sont réalisées en un incubateur avec 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphère. Jour 1: Préparation de l' appareil Placez le dispositif dans la machine à plasma O 2 et le traiter avec plasma O 2 à 90 W pendant 40 secondes pour rendre le canal microfluidique surfaces hydrophiles. Immédiatement après le traitement de surface, d'installer deux 14 aiguilles émoussées G en insérant directement les aiguilles dans les trous de 2 mm de diamètre percés dans la couche de PDMS au niveau des entrées de canal de gradient chimique. Assurez-vous que les aiguilles ne bloquent pas les canaux microfluidiques. Dessinez 0,8 ml de ddH 2 O en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 14 G émoussée. Injecter DDH 2 O dans le canal de gradient chimique depuis la sortie jusqu'à ce que l'eau coule à partir des deux aiguilles au niveau des orifices d' entrée. Préparer 1 ml de 50 pg / ml solution fibronectine en diluant fibronectine stock chez Dulbecco & #39; solution saline tamponnée au phosphate de (DPBS). Perfuser la solution de fibronectine à partir de la sortie du canal à gradient chimique en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 14 G émoussée jusqu'à ce que la solution circule à partir des deux aiguilles au niveau des orifices d'entrée. Incuber l'ensemble de l'appareil pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire classique. Jour 2: Cellule ensemencement et imagerie par microscopie cellule ensemencement Aspirer le milieu des cellules qui ont été cultivées depuis le jour 0 et laver les cellules avec 5 ml de DPBS 2 fois. Aspirer le DPBS, ajouter 2 ml de trypsine-EDTA, et on incube les cellules dans l'incubateur pendant 5 minutes pour détacher les cellules de la surface du flacon. Attendre jusqu'à ce que les cellules sont décollées et mises en suspension dans la solution et on ajoute 8 ml de milieu sans sérum (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimycotique solution) dans le ballon. Transférer la totalité du liquide dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 140 g pendant 5 min à température ambiante. </li> Aspirer le surnageant après centrifugation et ajouter une quantité appropriée du milieu sans sérum pour rendre la densité cellulaire finale 1 x 10 6 cellules / ml. Sortez le dispositif microfluidique préparé le jour 1. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre instrument de comptage automatique des cellules. Injecter un milieu sans sérum à partir de la sortie du canal à gradient chimique en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 14 G émoussée jusqu'à ce que le fluide circule à partir des deux aiguilles au niveau des orifices d'entrée. Injecter 200 ul de la suspension cellulaire à partir de la sortie du canal à gradient chimique. Observer la chambre de culture cellulaire dans le dispositif sous un microscope afin de confirmer que les cellules ont été introduites dans le canal microfluidique. Placez le dispositif dans un récipient humide (par exemple, une boîte en plastique avec ddH 2 O à l' intérieur) et le maintenir dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 heures pour favoriser l'adhérence des cellules sur la surface du dispositif. Préparation de REAGents pour la génération de gradient chimique Préparer le (SDF-1α) chimique à la concentration désirée (100 ng / ml) dans du milieu exempt de sérum. Dessinez le milieu sans sérum avec et sans le produit chimique en deux séparés 3 ml seringues reliées à des tubes de haute pureté. Mettre en place la seringue dans une pompe seringue avec un débit de 1 pl / min pour une utilisation ultérieure. Préparation des réactifs pour la production d'un gradient d'oxygène Faire 15 ml d'une solution 1 M de NaOH et 15 ml de 200 mg / ml de solution pyrogallol. Dessinez le NaOH et des solutions de pyrogallol en deux séparés 15 ml seringues connectées à haute pureté tube de PTFE et de tubes de haute pureté, respectivement. Mettre en place la seringue dans une pompe seringue à débit de 5 ul / min pour une utilisation ultérieure débit. configuration de l'appareil microfluidique Après l'incubation de 5 heures, prendre l'ensemble du dispositif et placez-le sur un diamètre boîte de Pétri de 15 cm. Fixer le dispositif dans la boîte de Pétri en utilisant du mastic adhésif. Transférer laBoîte de Pétri à un microscope d'imagerie de cellules vivantes dans un incubateur. Raccorder le tuyau à partir des seringues pour la génération du gradient chimique aux entrées du canal de gradient chimique. Branchez la sortie au tube menant à un réservoir de déchets. Mettre en marche la pompe à seringue avec des seringues pour la production d'un gradient chimique. Raccorder le tuyau de haute pureté à partir des seringues contenant NaOH et pyrogallol aux entrées du canal à gradient d'oxygène. Connecter le tuyau à la sortie pour recueillir les déchets. Mettre en marche la pompe à seringue avec des seringues pour la production d'un gradient d'oxygène. Ajouter environ 15 ml de ddH 2 O à la boîte de Pétri pour maintenir le dispositif hydratées. Mettre en place le microscope d'imagerie cellulaire en direct pour le temps écoulé de capture d'image, et de prendre une image toutes les 15 min. Jour 3: collecte et analyse des données Transférer les fichiers d'image capturées à un ordinateur. Analyser les images à l'aide d'un open source d'image d'unlogiciel alyse, ImageJ, avec un plugin open source pour le suivi manuel (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) et un logiciel gratuit chimiotactisme Tool (http://ibidi.com/xtproducts / fr / Software-et-image-Analyse / Manuel-image-Analyse / chimiotactisme-and-migration Tool) 15, 16. 3. Caractérisation des gradients REMARQUE: Les gradients chimiques et de l'oxygène peuvent être caractérisées, avant ou après les expériences cellulaires. Simulation numérique du gradient chimique Estimer la nature de l'écoulement laminaire de la microfluidique en utilisant la dynamique fluidiques de calcul (CFD). La caractérisation expérimentale du gradient d'oxygène Préparer un colorant fluorescent sensible à l'oxygène, le tris (2,2'-bipyridyle) ruthénium (III) hexahydraté, d'une solution dans l'eau à une concentration de 5mg / ml. Dessinez la solution de colorant sensible à l'oxygène en deux séparés 3 ml seringues reliées à des tubes de haute pureté. Mettre en place la seringue dans une pompe seringue à raison de 1 ul / min (identiques aux débits utilisés pour la génération du gradient chimique) d'écoulement. Branchez le tuyau des seringues aux entrées du canal de gradient chimique. Branchez la sortie au tube menant à un réservoir de déchets. Mettre en marche la pompe à seringue avec des seringues pour la production d'un gradient chimique. Mesurer l'intensité de fluorescence en utilisant un microscope inversé à fluorescence avec une lumière d'excitation passant à travers un filtre optique à 470 nm ± 20. Collecter la lumière d'émission à travers un filtre d'émission passe-haut 515 nm à l'aide d'une caméra CCD fraîche. Raccorder le tuyau de haute pureté à partir des seringues contenant NaOH et pyrogallol aux entrées du canal à gradient d'oxygène. Connecter le tuyau à la sortie pour recueillir les déchets. Tournez sur la pompe à seringue avec les seringues pour l'oxygènegénération de gradient. Recueillir les images de fluorescence du colorant sensible à l'oxygène qui circule dans la chambre de culture cellulaire. Arrêter l'écoulement de génération de gradient d'oxygène et débrancher tous les tuyaux dans le canal de génération d'oxygène. Connecter un tube de grande pureté à partir de bouteilles de gaz à la sortie du canal à gradient d'oxygène. Recueillir les images de fluorescence du colorant sensible à l'oxygène qui circule dans la chambre de culture cellulaire lors de l'écoulement de l'air, de l'azote pur et de l'oxygène pur dans la tubulure reliée au canal du gradient d'oxygène. Estimer les gradients d'oxygène en analysant les images de fluorescence en utilisant l'équation de Stern-Volmer selon les références 10 et 11.