Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

El éxito de anticuerpos terapéuticos continúa impulsando la inversión sustancial en el desarrollo de anticuerpos como comienza una ola de terapias de próxima generación. Se espera que el mercado de anticuerpo que se ha reformado por fragmentos de anticuerpos ^1, conjugados de anticuerpo-fármaco ^2, anticuerpos biespecíficos ³ y anticuerpos diseñados con propiedades favorables ^4. Otra clase ganando interés farmacéutico son bioequivalentes. anticuerpos biosimilares son "muy similares" replicar productos de un anticuerpo terapéutico que ya ha recibido la aprobación regulatoria. A biosimilar propuesto debe ser comparable con el anticuerpo iniciador con respecto a su estructura, la función, la toxicidad animal, la seguridad clínica y eficacia, farmacocinética (PK) humanos, la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad ^{5, 6.}

La aprobación rAtes de anticuerpos biosimilares han sido lentos debido a las limitaciones estrictas sobre la calidad final del producto. Los procesos de fabricación exactas tales como líneas celulares y condiciones de cultivo específico a través de las etapas de procesamiento finales pueden permanecer propietario. Lo que es más, la fabricación de anticuerpos implica inherentemente un grado de variabilidad que se puede agregar al desafío de producir un producto muy similar. Una caracterización fisicoquímica y biofísica exhaustiva y la comparación es bastante difícil, sin embargo, una serie de estudios que demuestran las características de los anticuerpos biosimilares están surgiendo en la literatura ^{7, 8, 9.}

Generación de un anticuerpo terapéutico comienza con la transfección de células huésped de mamífero con un vector que lleva los genes para el anticuerpo respectivo. diseño del vector, de línea y de cultivo celular condiciones son consideraciones clave para la creación de la exsistema de compresión.

Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden ser obtenidos de Banco de Drogas (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o publicaciones de investigación, incluidas las patentes. Por ejemplo, la secuencia de trastuzumab está disponible a través del Banco de Drogas (DB ID: DB00072). La secuencia de aminoácidos de las regiones variables puede someterse a diseño y optimización de genes para la síntesis en las especies huésped deseadas. Es importante para un anticuerpo biosimilar que ninguna modificación se hace a la secuencia de aminoácidos. Una vez sintetizados, los genes de anticuerpos se pueden subclonar en el vector apropiado de elección.

anticuerpos IgG humanos consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Expresión estrictamente regulados de ambas cadenas es esencial para la producción óptima de la proteína heteróloga IgG en células de mamíferos ^10. Intra, así como enlaces disulfuro entre cadenas tienen que ser formado y una serie de modificaciones posteriores a la traducción tiene que estar enintrodujo durante la biosíntesis de proteínas. Una serie de vectores están disponibles que se han diseñado específicamente para expresar genes de anticuerpos (consulte la Tabla de Materiales). Estos vectores en anticuerpos específicos por lo general expresan las regiones constantes de las cadenas tanto pesada y ligera de modo que sólo las regiones variables de cada cadena requieren clonación.

La transfección de células con dos constructos independientes (co-transfección) es el método más común para la entrega de genes pesados ​​y ligeros de la cadena que codifica. Es decir, cada gen es conducido por su propio promotor y transcribe como cadenas de anticuerpo separados antes de ser montado en el retículo endoplásmico. Por otra parte, los vectores de multi-cistrónicos tienen elementos internos sitio de entrada al ribosoma (IRES) incorporados que permiten la expresión de múltiples genes como un único transcrito de ARNm con la traducción permitida de las regiones internas del mRNA ^11. En este caso, los genes de cadena pesada y ligera que codifica se acoplan en un arrangement para lograr la co-expresión de ambas cadenas de anticuerpo ^{10, 12.}

Mientras que las células transfectadas transitoriamente rendimiento de proteína suficiente para realizar un número limitado de experimentos, las líneas celulares transfectadas de manera estable que han sido sometidos a selección para la integración del genoma pueden ofrecer rendimientos más altos. Las cantidades de proteína más altos permiten para el desarrollo del ensayo relativo a la caracterización in vitro y pueden proporcionar una indicación de la calidad del anticuerpo en consideración para aplicaciones posteriores tales como la línea celular clonal y la selección de candidatos de plomo.

El objetivo de este artículo es describir la expresión estable y purificación de un anticuerpo terapéutico producido en un sistema de expresión de mamífero. De hecho, este método se puede aplicar a la expresión de un anticuerpo biosimilar. El método puede ser utilizado para la caracterización inicial de los anticuerpos antes de proceder a la crítica, aunque ste tiempops de identificar un clon deseable para la fabricación a mayor escala. Por otra parte, este método se puede utilizar para expresar otras proteínas y no sólo los anticuerpos.

El siguiente protocolo describe la expresión detallada de trastuzumab anticuerpo terapéutico. Esta consiste en la preparación de ADN del vector seguido de transfección estable en la línea celular HEK-293 y la purificación de la proteína de anticuerpo por un método de cromatografía automatizado.