Summary

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Published: January 24, 2017
doi:

Summary

Этот протокол описывает получение терапевтического антитела в системе экспрессии млекопитающих. Описанные методы включают приготовление векторной ДНК, стабильной трансфекции и адаптации эмбриона человека линии клеток почки 293 без сыворотки, набор из крупных культур и очистки с использованием аффинной хроматографии.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

Успех терапевтических антител продолжает стимулировать значительные инвестиции в развитие антител, как начинается волна терапии следующего поколения. Рынок антител , как ожидается, будет переработанная фрагментами антител 1, антитело-лекарственное средство конъюгатов 2, биспецифические антитела 3 и сконструированных антител с благоприятными свойствами 4. Другой класс приобретает фармацевтический интерес являются биоподобий. Биоподобие антитела являются "очень похожи" реплицировать продукты терапевтического антитела, которое уже получил одобрение регулирующих органов. Предлагаемая биоподобие должна быть сравнима с отправителе антитела по отношению к его структуре, функции животных токсичности, клиническая эффективность и безопасность, человека фармакокинетики (PK), фармакодинамики (PD) и иммуногенности 5, 6.

Утверждение гАтеш из биоподобных антител медленно из-за строгих ограничений на качество конечного продукта. Точные производственные процессы, такие как специфические клеточные линии и условия культивирования до финальных стадий обработки может оставаться частной собственностью. Более того, производство антител, по своей сути предполагает определенную степень изменчивости, которая может добавить к проблеме получения весьма аналогичный продукт. Комплексный физико – химическая и биофизических характеристика и сравнение довольно сложно, но ряд исследований , демонстрирующих характеристики биоподобных антител появляются в литературе 7, 8, 9.

Генерирование терапевтическое антитело начинается с трансфекции клеток-хозяев млекопитающих вектором, несущим гены, для соответствующего антитела. Вектор дизайн, линия клеток и условия культивирования являются ключевыми факторами для создания эксприжимное система.

ДНК-последовательности антител могут быть получены из банка медикаментов (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) или научных публикаций, включая патенты. Например, последовательность трастузумаба доступна через банк лекарственных средств (DB ID: DB00072). Аминокислотная последовательность вариабельных областей могут пройти проектирование и оптимизацию генов для синтеза в желаемых видов хозяев. Это важно для биоподобие антитела, никакие модификации не сделано в аминокислотной последовательности. После того, как синтезирован, гены антител могут быть субклонировали в соответствующий вектор выбора.

Человеческие антитела IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Плотно регулируемую экспрессию обеих цепей имеет важное значение для оптимального производства гетерологичного белка IgG в клетках млекопитающих 10. Внутри- а также дисульфидные связи между цепями должны быть сформированы и ряд посттрансляционных модификаций должны быть вtroduced в процессе биосинтеза белка. Ряд векторов доступны, которые были разработаны специально, чтобы выразить гены антител (см табл материалов). Эти векторы антитела специфичные обычно выражают постоянные области как для тяжелых и легких цепей, так только Вариабельные области каждой цепи требуют клонирования.

Трансфекция клеток с двумя независимыми конструкциями (Котрансфекция) является наиболее распространенным подходом для доставки тяжелых и легких цепей генов, кодирующих. То есть, каждый ген приводится в движение своего собственного промотора и транскрибируется в виде отдельных цепей антитела перед сборкой в ​​эндоплазматический ретикулум. С другой стороны, мульти-cistronic векторы имеют внутренние рибосомы сайте вступления (IRES) элементы , включенные , которые делают возможной экспрессию множественных генов как одного транскрипта мРНК с переводом разрешенной из внутренних областей мРНК 11. В этом случае, тяжелые и легкие цепи гены, кодирующие соединены в Arrangement достичь коэкспрессии обоих цепей антитела 10, 12.

В то время как трансфицированы клетки дают достаточное количество белка, чтобы выполнить ограниченное число экспериментов, стабильно трансфецированные клеточные линии, которые претерпели выбор для интеграции генома может обеспечить более высокие урожаи. Более высокие количества белка позволяют для развития анализа , относящейся к характеристике в пробирке и может обеспечивать индикацию качества антител в рассмотрении для последующих применений , таких как клональной клеточной линии и свинцового отбора кандидатов.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать стабильную экспрессию и очистку терапевтического антитела, продуцируемого в системе экспрессии млекопитающих. В самом деле, этот метод может быть применен к экспрессии биоподобие антитела. Метод может быть использован для начальной характеризации антител, прежде чем перейти к критическим, хотя и трудоемкого STEпс идентификации желаемого клона для увеличения производства масштаба. Более того, этот метод может быть использован, чтобы выразить другие белки, а не только антитела.

Следующее подробное протокол описывает экспрессию терапевтического антитело трастузумаб. Она состоит из подготовки векторной ДНК с последующей стабильной трансфекции в клеточной линии и очистки белка антитела НЕК-293 с помощью автоматизированного метода хроматографического.

Protocol

Примечание: Подходящий экспрессирующий вектор млекопитающих необходимо использовать для этого протокола. Здесь одна конструкция , содержащая две кассеты экспрессии используется (т.е. тяжелой и легкой цепи выражение приводится в движение отдельными промоутеров). Трастузумаб тяжелые и легки…

Representative Results

Стабильное производство трастузумаб путем трансфекции клеток НЕК-293 , была подтверждена с использованием био-слойный интерферометрии (BLI) , как представлено на рисунке 1. Стандартной кривой IgG был сгенерирован путем измерения связывания скорости между станда?…

Discussion

Этот протокол подробно трансфекцией стабильной экспрессии и очистки терапевтического антитела в клетках НЕК-293. Стабильная экспрессия генов антител является первым шагом в генерации антител, производящих клеточную линию для разработки и производства терапевтического антитела. В то …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

Materials

pFUSE vector series N/A InvivoGen Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series N/A ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series N/A Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ 61883 Addgene Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar fas-hg-s Jomar Life Research Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB fas-hg-l Jomar Life Research Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% G6279 Sigma-Aldrich Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit G221020 Astral Scientific Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells R790-07 Life Technologies HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium 12338-018 Life Technologies Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 K4894 Sigma-Aldrich Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose  11995-065 Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum 10082-147 Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  23966 Polysciences, Inc. Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM 12309-050 Life Technologies Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution ant-hg-1 Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO) AJA2225 Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone) LP0042B Thermo Fisher Scientific Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml 09-2051-100 Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column GE17-0403-01 Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100 28406266 GE Healthcare Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl G2879 Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate BIOC2123 Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  BIOCB0035 Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 BIOSD8146 Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) UFC803008/UFC903008 Merck Millipore Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit 23227 Thermo Fisher Scientific
BLItz System 45-5000 fortéBIO Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors 18-5010 fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution 786-502 Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS) AM0486 Astral Scientific
TEMED AM0761 Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250 786-498 Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard 1610374 Bio-Rad

References

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. . . Food and Drug Administration. 22, (2015).
  6. . . European Medicines Agency. 13, (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

Play Video

Cite This Article
Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

View Video