Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

O sucesso de anticorpos terapêuticos continua a impulsionar o investimento substancial no desenvolvimento de anticorpos como uma onda de terapêuticas próxima geração começa. O mercado de anticorpo deverá ser remodelada por fragmentos de anticorpos ^1, conjugados de anticorpos ^droga-2, anticorpos biespecíficos ³ e anticorpos modificados com propriedades favoráveis ^4. Outra classe ganhando interesse farmacêutico são biossimilares. anticorpos biossimilares são "altamente semelhantes" replicar produtos de um anticorpo terapêutico que já recebeu aprovação regulatória. A biossimilar proposto deve ser comparável com o anticorpo originador no que diz respeito à sua estrutura, função, toxicidade animal, a segurança clínica e eficácia, farmacocinética humana (PK), farmacodinâmica (PD) e imunogenicidade ^{5, 6.}

A aprovação rates de anticorpos biossimilares têm sido lentos devido às limitações estritas sobre a qualidade final do produto. Os processos de fabrico exactas, tais como linhas de células e condições de cultura específica através dos passos de processamento finais podem permanecer proprietária. O que é mais, a produção de anticorpos envolve inerentemente um grau de variabilidade que pode adicionar ao desafio de produzir um produto altamente semelhantes. A caracterização e comparação físico-química e biofísica abrangente é bastante difícil, mas uma série de estudos que demonstram as características dos anticorpos biossimilares estão surgindo na literatura ^{7, 8, 9.}

Geração de um anticorpo terapêutico começa com a transfecção de células hospedeiras de mamífero com um vector portador de genes para o respectivo anticorpo. projeto do vetor, as condições da linha celular e cultura são aspectos fundamentais para configurar o exsistema de pressão.

As sequências de DNA de anticorpos podem ser provenientes de Drogas Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou publicações de pesquisa, incluindo patentes. Por exemplo, a sequência de trastuzumab está disponível através da droga Bank (DB ID: DB00072). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis ​​podem ser submetidos a concepção do gene e a optimização para a síntese nas espécies hospedeiras desejadas. É importante para um anticorpo biológico similar que nenhuma modificação é feita com a sequência de aminoácidos. Uma vez sintetizados, os genes de anticorpo pode ser subclonado no vector apropriado de escolha.

anticorpos IgG humana consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Expressão fortemente regulada de ambas as cadeias é essencial para a produção óptima de proteína IgG heterólogo em células de mamífero ^10. Intra-, bem como ligações dissulfureto inter-cadeias tem que ser formado e uma série de modificações pós-tradução tem que estar emtroduced durante a biossíntese da proteína. Uma série de vectores estão disponíveis, que foram especificamente concebidos para expressar genes de anticorpos (consultar a Tabela de Materiais). Estes vectores específicos de anticorpos normalmente expressam as regiões constantes para ambas as cadeias pesada e leve de modo que apenas as regiões variáveis ​​de cada cadeia requerem clonagem.

A transfecção de células com duas construções independentes (co-transfecção), é a abordagem mais comum para a libertação de genes pesada e leve que codifica cadeia. Isto é, cada gene é conduzido pelo seu próprio promotor e transcrito como cadeias de anticorpo separadas antes de serem montadas no retículo endoplasmático. Por outro lado, os vectores multi-cistrónico têm elementos internos local de entrada de ribossoma (IRES) incorporados que permitem a expressão de múltiplos genes como um único transcrito de ARNm com tradução permitida a partir de regiões internas do ARNm ^11. Neste exemplo, as pesadas e leves genes codificadores da cadeia são acoplados numa Arrangement para conseguir a co-expressão de ambas as cadeias de anticorpos ^{10, 12.}

Enquanto as células transfectadas transientemente produzir proteína suficiente para executar um número limitado de experiências, as linhas celulares transfectadas de forma estável que tenham sido submetidos a selecção para a integração do genoma pode proporcionar rendimentos mais elevados. Quantidades de proteína mais elevado para permitir que o desenvolvimento do ensaio, relativa a caracterização in vitro e pode proporcionar uma indicação da qualidade de anticorpos em consideração para aplicações a jusante, tais como a linha celular clonal e selecção de candidatos de chumbo.

O objetivo deste artigo é descrever a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico produzido num sistema de expressão de mamífero. Com efeito, este método pode ser aplicado para a expressão de um anticorpo biológico similar. O método pode ser utilizado para a caracterização inicial de anticorpos, antes de prosseguir para o crítico, embora ste demoradops de identificar um clone desejável para o fabrico de maior escala. Além disso, este método pode ser utilizado para expressar proteínas e outros não apenas anticorpos.

O protocolo detalhado seguinte descreve a expressão do anticorpo trastuzumab terapêutica. Esta consiste na preparação de DNA do vector seguido por transfecção estável na linha celular HEK-293 e a purificação da proteína do anticorpo por um método de cromatografia automatizado.