הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.
Abstract
Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.
Introduction
ההצלחה של נוגדנים טיפוליים ממשיכה לנסוע השקעה ניכרת לתוך פיתוח נוגדן כגל של הרפוי דור הבאים מתחיל. שוק הנוגדנים צפוי לעצב מחדש מרסיסי נוגדן 1, conjugates 2, נוגדני bispecific סמי נוגדן 3 ונוגדנים מהונדסים עם תכונות חיוביות 4. מחלקה נוספת זוכה להתעניינות מחודשת התרופות הם biosimilars. נוגדני Biosimilar הם "מאוד דומים" לשכפל מוצרים של נוגדן טיפולי קבל אישור רגולטורים כבר. Biosimilar מוצעת חייבת להיות זהה לזו הנוגדן היוזם לגבי המבנה שלה, פונקציה, רעילויות בבעלי חיים, בטיחות ויעילות קליניות, פרמקוקינטיקה אדם (PK), פרמקודינמיקה (PD) ו חיסוני 5, 6.
האישור rאטס של נוגדני biosimilar היה איטי בשל האילוצים הקפדנים על האיכות הסופית של המוצר. תהליכי הייצור המדויקים כגון ספציפי קווי תאים ותנאי culturing ועד השלבים לעיבוד הסופיים יכולים להישאר קניינית. יתרה מזאת, בייצור של נוגדני מטבעו כרוך מידה של השתנות אשר יכולים להוסיף האתגר בייצור מוצר דומה מאוד. אפיון physiochemical ו biophysical מקיף והשוואה קשה למדי, עדיין מספר מחקרים הוכחת המאפיינים של נוגדנים biosimilar הם מתעוררים בספרות 7, 8, 9.
יצירת נוגדנים טיפוליים מתחילה עם transfection של תאים לארח יונקים עם וקטור הנושא את הגנים של הנוגדן בהתאמה. תנאי עיצוב וקטור, שורת התאים וההתרבות הם שיקולים מרכזיים להקמה לשעברמערכת pression.
רצפי DNA של נוגדנים ניתן מקורות מבנק והתרופות (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) או פרסומי מחקר לרבות פטנטים. לדוגמה, את הרצף של trastuzumab זמין באמצעות בנק והתרופות (ID DB: DB00072). רצף החומצות האמינו של האזורים המשתנים יכול לעבור עיצוב גן ואופטימיזציה לסינתזה של פונדקאי הרצוי. חשוב נוגדן biosimilar ששום שינוי הוא עשה את רצף החומצות האמיניות. לאחר מסונתז, גני נוגדן ניתן subcloned לתוך הווקטור המתאים בחירה.
נוגדני IgG אדם מורכבים משתי שרשרות כבדות זהות ושתי רשתות אור זהות. בחוזקה ביטוי מוסדר הן שרשראות חיוני לייצור אופטימלי של חלבון IgG Heterologous בתאי יונקים 10. התוך וכן אג"ח דיסולפיד הבין-שרשרת צריך להיווצר ומספר שלאחר translational שינויים צריך להיותtroduced במהלך ביוסינתזה חלבון. מספר הווקטורים זמינים אשר עוצב במיוחד כדי לבטא גני נוגדן (עיינו בטבלה של חומרים). וקטורי נוגדנים ספציפיים אלה בדרך כלל להביע האזורים המתמידים הוא שרשרות כבדות ואור כך שרק האזורים המשתנים של כל שרשרת דורשים שיבוט.
Transfection של תאים עם שני מבנים עצמאיים (-transfection שיתוף) הוא הגישה הנפוצה ביותר להעברת גני קידוד שרשרת כבדה וקלים. כלומר, כל גן הוא מונע על ידי אמרגן משלה עבד כמו שרשרות נוגדן נפרדות בטרם התכנס reticulum endoplasmic. מצד השני, וקטורים רבים cistronic יש אתר כניסה הריבוזום (IRES) אלמנטים משולבים המאפשרים ביטוי של גנים מרובים כמו תעתיק mRNA יחיד עם תרגום מותר מאזורים פנימיים של mRNA 11. במקרה זה, הגנים המקודדים-שרשרת כבדה ואור הם מצמידים בבית arrangement להשיג ביטוי שיתוף של שני שרשראות נוגדן 10, 12.
בעוד תאי transfected זמני להניב מספיק חלבון כדי לבצע מספר מוגבל של ניסויים, שורות תאי transfected ביציבות שעברו בחירה לשילוב הגנום יכולות לספק תשואות גבוהות יותר. כמויות חלבון גבוהות לאפשר התפתחות assay הנוגעת אפיון במבחנה יכולות לספק אינדיקציה של איכות נוגדן בתמורת יישומים במורד כגון שורת תאים משובטת ובחירת מועמד מובילה.
מטרת מאמר זה היא לתאר את הביטוי וטיהור היציבים של נוגדן רפואי היוצר מערכת ביטוי יונקת. אכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הביטוי של נוגדן biosimilar. השיטה יכולה לשמש עבור האפיון הראשוני של נוגדנים לפני שתמשיך הלאה אל קריטי, אם כי זמן רב STEps של זיהוי שיבוט רצוי לייצור בקנה מידה גדול יותר. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים אחרים ולא רק נוגדנים.
הפרוטוקול המפורט הבא מתאר את הביטוי של trastuzumab נוגדנים הטיפולי. זה מורכב של הכנת DNA וקטור ואחריו transfection יציבה שורת תאים HEK-293 וטיהור של חלבון נוגדנים על ידי שיטה chromatographic אוטומטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את transfection, ביטוי וטיהור יציב של נוגדן רפואי בתאי HEK-293. ביטוי יציב של גני נוגדן הוא הצעד הראשון ביצירת קו תא מייצר נוגדנים לפיתוח והייצור של נוגדנים טיפוליים. בעוד שחלה של אוגר סיני (CHO) תאים נשארים פלטפורמת הביטוי מועדף על חלבונים תרופתיים, שורת תאי HEK-29…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.
Materials
| pFUSE vector series | N/A | InvivoGen | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | N/A | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | N/A | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | 61883 | Addgene | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | fas-hg-s | Jomar Life Research | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | fas-hg-l | Jomar Life Research | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | G6279 | Sigma-Aldrich | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | G221020 | Astral Scientific | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | R790-07 | Life Technologies | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | 12338-018 | Life Technologies | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | K4894 | Sigma-Aldrich | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| DMEM, high glucose | 11995-065 | Life Technologies | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | 10082-147 | Life Technologies | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | 23966 | Polysciences, Inc. | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use. |
| OptiPro SFM | 12309-050 | Life Technologies | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | ant-hg-1 | Jomar Life Research | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | AJA2225 | Thermo Fisher Scientific | |
| Tryptone (casein peptone) | LP0042B | Thermo Fisher Scientific | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | 09-2051-100 | Astral Scientific | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | GE17-0403-01 | Sigma-Aldrich | |
| AKTApurifier 100 | 28406266 | GE Healthcare | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | G2879 | Sigma-Aldrich | |
| Citric Acid, monohydrate | BIOC2123 | Astral Scientific | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | BIOCB0035 | Astral Scientific | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | BIOSD8146 | Astral Scientific | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | UFC803008/UFC903008 | Merck Millipore | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher Scientific | |
| BLItz System | 45-5000 | fortéBIO | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | 18-5010 | fortéBIO | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | 786-502 | Astral Scientific | |
| Ammonium Persulfate (APS) | AM0486 | Astral Scientific | |
| TEMED | AM0761 | Astral Scientific | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | 786-498 | Astral Scientific | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | 1610374 | Bio-Rad |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- . . Food and Drug Administration. 22, (2015).
- . . European Medicines Agency. 13, (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
