L'échelle du laboratoire: Production et purification d'un anticorps thérapeutique

Le succès des anticorps thérapeutiques continue à conduire des investissements importants dans le développement d'anticorps comme une vague de produits thérapeutiques de prochaine génération commence. Le marché des anticorps à refaçonné par des fragments d'anticorps ^1, conjugués anticorps-médicament ^2, des anticorps bispécifiques ³ et des anticorps modifiés avec des propriétés favorables ^4. Une autre classe gagne intérêt pharmaceutique sont biosimilaires. anticorps biosimilaires sont «très similaires» répliquer les produits d'un anticorps thérapeutique qui a déjà reçu l'approbation réglementaire. Un biosimilaire proposé doit être comparable avec l'anticorps donneur par rapport à sa structure, la fonction, la toxicité animale, la sécurité clinique et de l' efficacité, la pharmacocinétique humaine (PK), pharmacodynamique (PD) et l' immunogénicité ^{5, 6.}

L'approbation rates d'anticorps biosimilaires ont été lents en raison des contraintes strictes sur la qualité finale du produit. Les procédés de fabrication spécifiques exactes, telles que des lignées cellulaires et conditions de culture à travers les dernières étapes de traitement peuvent rester propriétaire. Qui plus est, la fabrication d'anticorps implique intrinsèquement un degré de variabilité qui peut ajouter au défi de produire un produit très similaire. Une caractérisation et la comparaison physicochimique et biophysique global est assez difficile, mais un certain nombre d'études démontrant les caractéristiques des anticorps biosimilaires apparaissent dans la littérature ^{7, 8, 9.}

La génération d'un anticorps thérapeutique commence par la transfection de cellules hôtes de mammifère avec un vecteur portant des gènes de l'anticorps respectif. Vector design, les conditions de ligne et de la culture cellulaire sont des éléments essentiels pour la mise en place de l'exSystème de compression.

Les séquences d'ADN d'anticorps peuvent provenir de la Banque du médicament (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou de publications de recherche, y compris les brevets. Par exemple, la séquence de trastuzumab est disponible par le biais de la Banque Drug (DB ID: DB00072). La séquence d'acides aminés des régions variables peut subir une conception et une optimisation génétique pour la synthèse de l'espèce hôte souhaité. Il est important pour un anticorps biosimilar qu'aucune modification ne soit apportée à la séquence d'acides aminés. Une fois synthétisés, les gènes d'anticorps peuvent être sous-clonés dans le vecteur approprié de choix.

Les anticorps IgG humains se composent de deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques. Expression régulée Étroitement des deux chaînes est essentiel pour une production optimale de la protéine IgG hétérologue dans des cellules de mammifères ^10. Intra- ainsi que des liaisons disulfure inter-chaînes doivent être formées et un certain nombre de modifications post-traductionnelles doivent être entroduced pendant la biosynthèse des protéines. Un certain nombre de vecteurs sont disponibles qui ont été conçus spécifiquement pour exprimer des gènes d'anticorps (voir le tableau des matériaux). Ces vecteurs expriment des anticorps spécifiques à des régions constantes généralement à la fois des chaînes lourdes et légères de sorte que seules les régions variables de chaque chaîne nécessitent le clonage.

La transfection de cellules avec deux constructions indépendantes (co-transfection) est l'approche la plus courante pour la délivrance de gènes de la chaîne codant lourdes et légères. Autrement dit, chaque gène est entraînée par son propre promoteur et transcrit sous forme de chaînes d'anticorps séparées avant d'être assemblés dans le réticulum endoplasmique. D'autre part, des vecteurs multi-cistroniques comportent des éléments internes du ribosome entry site (IRES) incorporées qui permettent l' expression de gènes multiples comme un seul transcrit d'ARNm avec une traduction permise à partir de régions internes de l'ARNm ^11. Dans ce cas, les gènes codant pour des chaînes lourdes et légères sont couplées à une arrangEMENT pour réaliser la co-expression des deux chaînes d' anticorps ^{10, 12.}

Alors que les cellules produisent une protéine transfectées de manière transitoire suffisante pour effectuer un nombre limité d'expériences, des lignées de cellules transfectées de manière stable qui ont subi une sélection pour l'intégration du génome peuvent fournir des rendements plus élevés. Des quantités plus élevées de protéines permettent le développement de tests relatifs à la caractérisation in vitro peuvent fournir une indication de la qualité de l' anticorps en contrepartie des applications en aval telles que la lignée cellulaire clonale et la sélection des candidats au plomb.

Le but de cet article est de décrire l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique produite dans un système d'expression mammalien. En effet, cette méthode peut être appliquée à l'expression d'un anticorps biosimilar. La méthode peut être utilisée pour la caractérisation initiale des anticorps avant de procéder à la critique, mais ste de tempsps d'identifier un clone souhaitable pour agrandir la fabrication à grande échelle. En outre, ce procédé peut être utilisé pour exprimer d'autres protéines et non seulement des anticorps.

Le protocole détaillé ci-dessous décrit l'expression de thérapeutique trastuzumab d'anticorps. Il est composé de la préparation d'ADN vecteur, suivie par une transfection stable dans la lignée cellulaire HEK-293 et ​​la purification de la protéine d'anticorps par une méthode de chromatographie automatisée.