Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Der Erfolg von therapeutischen Antikörpern weiterhin erhebliche Investitionen in die Antikörperentwicklung zu fahren, als eine Welle der nächsten Generation Therapeutika beginnt. Der Antikörper – Markt wird erwartet , dass durch Antikörperfragmente ^1, Antikörper-Wirkstoff – Konjugate ^2, bispezifische Antikörper ³ und manipulierte Antikörper mit günstigen Eigenschaften ⁴ neu gestaltet werden. Eine andere Klasse pharmazeutischem Interesse zu gewinnen sind Biosimilars. Biosimilar-Antikörper sind "sehr ähnlich" replizieren Produkte eines therapeutischen Antikörper, der bereits die Zulassung erhalten hat. Eine vorgeschlagene Biosimilar muss mit dem Absender Antikörper in Bezug auf seine Struktur, Funktion, Tier Toxizität, klinische Sicherheit und Wirksamkeit, Pharmakokinetik beim Menschen (PK), Pharmakodynamik (PD) und Immunogenität ^{5, 6} vergleichbar sein.

Die Zulassung rAtes von Biosimilar-Antikörper auf die endgültige Qualität des Produkts aufgrund der strengen Einschränkungen langsam. Die genauen Herstellungsverfahren, wie spezifische Zelllinien und Kulturbedingungen bis hin zu den letzten Verarbeitungsschritte können proprietäre bleiben. Was mehr ist, beinhaltet die Herstellung von Antikörpern inhärent einen Grad an Variabilität, die einen sehr ähnlichen Produkt zur Herstellung der Herausforderung hinzufügen. Eine umfassende physikalisch – chemischen und biophysikalischen Charakterisierung und Vergleich ist ziemlich schwierig, noch eine Reihe von Studien die Merkmale biosimilar Antikörper entstehen in der Literatur ^{7, 8, 9} demonstriert.

einen therapeutischen Antikörper zu erzeugen beginnt mit Transfektion von Säugerwirtszellen mit einem Vektor, der die Gene für die jeweiligen Antikörper trägt. Vector Design, Zelllinie und Kulturbedingungen sind wichtige Überlegungen für die Ex-Einrichtungpression System.

Die DNA-Sequenzen von Antikörpern aus Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) oder Research-Publikationen einschließlich Patente bezogen werden. Beispielsweise ist die Sequenz von Trastuzumab erhältlich durch Drug Bank (DB ID: DB00072). Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen können Gen-Design und die Optimierung für die Synthese in die gewünschten Wirtsspezies unterziehen. Es ist wichtig, für eine biosimilar Antikörper, der keine Modifikation der Aminosäuresequenz vorgenommen wird. Einmal synthetisiert, können Antikörpergene subkloniert in den entsprechenden Vektor der Wahl werden.

Humane IgG-Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Eng regulierte Expression beider Ketten ¹⁰ für eine optimale Produktion von heterologen IgG – Protein in Säugerzellen wesentlich. Intra- als auch Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so ausgebildet und eine Reihe von post-translationalen Modifikationen werden müssen, werden inwährend der Proteinbiosynthese eingeführt. Eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die speziell zum Ausdruck Antikörpergene (siehe Tabelle der Materialien) entwickelt wurden. Diese Antikörper-spezifischen Vektoren Express in der Regel die konstanten Regionen für die schweren und leichten Ketten, so dass nur die variablen Regionen jeder Kette Klonen erfordern.

Die Transfektion von Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukte (Co-Transfektion) ist die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bereitstellung von schweren und leichten Kette kodierenden Gene. Das heißt, jedes Gen mit seinem eigenen Promotor transkribiert und als getrennte Antikörperketten angetrieben, bevor sie in das endoplasmatische Retikulum montiert. Auf der anderen Seite haben Mehr cistronische Vektoren IRES (IRES) -Elemente eingebaut , das mit Übersetzung aus dem inneren Regionen der mRNA ¹¹ erlaubt die Expression von mehreren Genen als eine einzelne mRNA – Transkripts zu ermöglichen. In diesem Fall werden die schwere und leichte Kette kodierenden Gene in einer arrang gekoppeltenement Coexpression beider Antikörperketten zu erreichen , ^{10, 12.}

Während transient transfizierten Zellen ausreichend Protein ergeben eine begrenzte Anzahl von Versuchen durchzuführen, stabil transfizierten Zelllinien, die höhere Ausbeuten liefern Selektion für Genom-Integration unterzogen wurden. Höhere Proteinmengen ermöglichen Entwicklung Assay in – vitro – Charakterisierung im Zusammenhang und kann einen Hinweis auf Antikörper Qualität als Gegenleistung für Downstream – Anwendungen wie klonalen Zelllinie und Blei Kandidatenauswahl bieten.

Das Ziel dieses Artikels ist die stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugerexpressionssystem zu beschreiben. Tatsächlich kann dieses Verfahren auf die Expression eines Antikörpers biosimilar angewendet werden. Das Verfahren kann für die anfängliche Charakterisierung von Antikörpern vor dem Fortfahren auf den kritischen, wenn auch zeitraubend Ste verwendet werdenps eines gewünschten Klon für größere Fertigungs identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um andere Proteine ​​zu exprimieren und nicht nur Antikörper.

Die folgende detaillierte Protokoll beschreibt die Expression therapeutischer Antikörper Trastuzumab. Diese besteht aus Zubereitung DNA des Vektors durch stabile Transfektion in HEK-293-Zelllinie und Reinigung von Antikörperprotein durch ein automatisiertes chromatographische Verfahren gefolgt.