مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية
Summary
يصف هذا البروتوكول إنتاج الأجسام المضادة العلاجية في نظام التعبير الثدييات. وتشمل الأساليب المذكورة إعداد الحمض النووي ناقلات، ترنسفكأيشن مستقرة والتكيف المصل خالية من الجنينية خط الخلية الكلى 293 البشري، وإنشاء الثقافات على نطاق واسع وتنقية باستخدام تقارب اللوني.
Abstract
Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.
Introduction
استمر نجاح الأجسام المضادة العلاجية لدفع استثمارات كبيرة في تطوير الأجسام المضادة كوسيلة لموجة من العلاجات الجيل القادم تبدأ. ومن المتوقع أن يتم إعادة تشكيل بشظايا الضد 1، تقارن الضد المخدرات 2، والأجسام المضادة bispecific 3 والأجسام المضادة هندسيا مع خصائص مواتية 4 السوق الأجسام المضادة. فئة أخرى كسب الفائدة الدوائية هي البدائل الحيوية. الأجسام المضادة بدائل حيوية هي "مشابهة للغاية" تكرار المنتجات من الأجسام المضادة العلاجية التي حصلت بالفعل على موافقة الجهات التنظيمية. يجب أن تكون بدائل حيوية المقترحة قابلة للمقارنة مع الأجسام المضادة المنشئ فيما يتعلق بنيته، وظيفة، سمية الحيوانية والسلامة السريرية والفعالية والدوائية الإنسان (PK)، الدوائية (PD) والمناعية 5، 6.
موافقة صوقد آتش الأجسام المضادة بدائل حيوية بطيئا بسبب القيود الصارمة على الجودة النهائية للمنتج. عمليات التصنيع الدقيقة مثل خطوط الخلايا وشروط زراعة محددة وصولا إلى خطوات المعالجة النهائية يمكن أن تبقى الملكية. ما هو أكثر من ذلك، تصنيع الأجسام المضادة ينطوي بطبيعته على درجة من التباين التي يمكن أن تضيف إلى التحدي المتمثل في إنتاج منتج مماثل للغاية. توصيف والمقارنة الفيزيائية والفيزياء الحيوية شامل من الصعب جدا، ولكن عددا من الدراسات مما يدل على خصائص الأجسام المضادة بدائل حيوية تظهر في الأدب 7، 8، 9.
توليد الأجسام المضادة العلاجية يبدأ ترنسفكأيشن من الخلايا المضيفة الثدييات مع ناقلات تحمل جينات الأضداد منها. تصميم ناقلات، خط الخلية والثقافة الشروط هي الاعتبارات الأساسية لإعداد السابقنظام الضغط و.
تسلسل الحمض النووي من الأجسام المضادة يمكن أن يكون مصدر من البنك المخدرات (www.drugbank.ca)، IMGT (www.igmt.org) أو المنشورات البحثية بما فيها براءات الاختراع. على سبيل المثال، وتسلسل تراستوزوماب يتوفر من خلال بنك المخدرات (ID DB: DB00072). تسلسل الأحماض الأمينية من المناطق المتغيرة يمكن أن يخضع تصميم الجينات والاستغلال الامثل للتركيب في الأنواع المضيفة المطلوب. من المهم بالنسبة الأجسام المضادة بدائل حيوية أن يتم إجراء أي تعديل لتسلسل الأحماض الأمينية. مرة واحدة توليفها، الجينات الأجسام المضادة يمكن subcloned في ناقلات المناسبة في الاختيار.
تتكون الأجسام المضادة البشرية من سلسلتين الثقيلة متطابقة وسلسلتين ضوء متطابقة. التعبير ينظم بإحكام كل السلاسل هو ضروري لإنتاج الأمثل للمغاير البروتين مفتش في خلايا الثدييات 10. داخل الإقليم مثل جيدا يجب أن تشكل السندات ثاني كبريتيد بين سلسلة وعدد من التعديلات بعد متعدية يجب أن تكون فيعرضوا خلال الحيوي البروتين. تتوفر التي تم تصميمها خصيصا للتعبير عن الجينات الأجسام المضادة (الرجوع إلى جدول المواد) وهناك عدد من ناقلات. هذه النواقل الضد محددة عادة ما تعبر عن ومناطق ثابتة لسلاسل حد سواء الثقيلة والخفيفة وذلك فقط في مناطق مختلفة من كل سلسلة تتطلب الاستنساخ.
ترنسفكأيشن من الخلايا مع اثنين من بنيات المستقلة (شارك في ترنسفكأيشن) هو النهج الأكثر شيوعا لإيصال الجينات الثقيلة والخفيفة ترميز السلسلة. وهذا هو، هو الدافع وراء كل جين من قبل المروج الخاص بها ونسخها كما سلاسل الأجسام المضادة منفصلة قبل أن يتم تجميعها في الشبكة الإندوبلازمية. من ناحية أخرى، ناقلات متعددة cistronic لها العناصر الداخلية الريبوسوم دخول موقع (IRES) تأسست التي تسمح التعبير عن الجينات متعددة كما نسخة مرنا واحد مع ترجمة المسموح بها من المناطق الداخلية للمرنا 11. في هذه الحالة، تقترن جينات ترميز السلسلة الثقيلة والخفيفة في arrangement لتحقيق التعاون في التعبير عن كل من سلاسل الأجسام المضادة 10 و 12.
في حين أن الخلايا transfected عابر إنتاج البروتين الكافي لإنجاز عدد محدود من التجارب، وخطوط الخلايا ستابلي التي خضعت لاختيار التكامل الجينوم يمكن أن يحقق عائدات أعلى. ارتفاع كميات البروتين تسمح للتنمية فحص المتعلقة في المختبر توصيف ويمكن أن توفر مؤشرا على نوعية الأجسام المضادة في الاعتبار لتطبيقات المصب مثل خط خلية نسيلي والرائدة اختيار المرشحين.
والهدف من هذه المقالة هو لوصف التعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية التي تنتج في نظام التعبير الثدييات. في الواقع، يمكن تطبيق هذه الطريقة للتعبير عن الأجسام المضادة بدائل حيوية. ويمكن استخدام طريقة لتوصيف الأولي من الأجسام المضادة قبل الشروع في لالحرجة، وإن كان الظريف تستغرق وقتا طويلاملاحظة تحديد استنساخ المرغوب فيه التصنيع على نطاق أوسع. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الأخرى، وليس الأجسام المضادة فقط.
يصف بروتوكول مفصلة التالية التعبير عن تراستوزوماب الأجسام المضادة العلاجية. وهذا يتكون من إعداد الحمض النووي ناقلات تليها ترنسفكأيشن مستقرة في خط خلية كلوة-293 و تنقية البروتين الأجسام المضادة باستخدام أسلوب الكروماتوغرافي الآلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل هذا البروتوكول ترنسفكأيشن والتعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية في كلوة-293 الخلايا. التعبير مستقر للجينات الجسم المضاد هو الخطوة الأولى في توليد خط الخلية المنتجة للأجسام المضادة لتطوير وتصنيع الأجسام المضادة العلاجية. في حين الصيني الهامستر المبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.
Materials
| pFUSE vector series | N/A | InvivoGen | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | N/A | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | N/A | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | 61883 | Addgene | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | fas-hg-s | Jomar Life Research | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | fas-hg-l | Jomar Life Research | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | G6279 | Sigma-Aldrich | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | G221020 | Astral Scientific | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | R790-07 | Life Technologies | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | 12338-018 | Life Technologies | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | K4894 | Sigma-Aldrich | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| DMEM, high glucose | 11995-065 | Life Technologies | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | 10082-147 | Life Technologies | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | 23966 | Polysciences, Inc. | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use. |
| OptiPro SFM | 12309-050 | Life Technologies | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | ant-hg-1 | Jomar Life Research | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | AJA2225 | Thermo Fisher Scientific | |
| Tryptone (casein peptone) | LP0042B | Thermo Fisher Scientific | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | 09-2051-100 | Astral Scientific | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | GE17-0403-01 | Sigma-Aldrich | |
| AKTApurifier 100 | 28406266 | GE Healthcare | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | G2879 | Sigma-Aldrich | |
| Citric Acid, monohydrate | BIOC2123 | Astral Scientific | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | BIOCB0035 | Astral Scientific | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | BIOSD8146 | Astral Scientific | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | UFC803008/UFC903008 | Merck Millipore | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher Scientific | |
| BLItz System | 45-5000 | fortéBIO | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | 18-5010 | fortéBIO | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | 786-502 | Astral Scientific | |
| Ammonium Persulfate (APS) | AM0486 | Astral Scientific | |
| TEMED | AM0761 | Astral Scientific | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | 786-498 | Astral Scientific | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | 1610374 | Bio-Rad |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- . . Food and Drug Administration. 22, (2015).
- . . European Medicines Agency. 13, (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
