Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Одной из основных проблем здравоохранения в 21 – ^м веке являются нейродегенеративные заболевания , такие как болезнь Альцгеймера (AD). Tau представляет собой ассоциированный с микротрубочками белок, который стимулирует образование микротрубочек (МТ). Tau в равной степени участвуют в нескольких нейродегенеративных расстройств, так называемые тауопатий, из которых наиболее известным является AD. В этих расстройств, Tau автопортреты агрегатов в спаренных спиральных нитей () и пневмо – гидравлическая система подачи обнаруживается изменение многих остатков путем посттрансляционных модификаций (PTMs) , такие как фосфорилирования ^1. Фосфорилирования белка тау участвует как в регуляции его физиологической функции стабилизации МП и патологической потерей функции, характеризующей нейроны AD.

Кроме того, тау – белок, когда интегрированный в пневмо – гидравлическая система подачи в пораженных нейронов, неизменно гиперфосфорилированного ^2. В отличие от обычного Tau, который содержит 2-3 фосфатные группы, то гиперфосфорилированного Tau в пневмо-гидравлическая система подачи содержит от 5 до 9 Phosphatе группы ^3. Гиперфосфорилированию Tau соответствует и к увеличению по сравнению со стехиометрическим на некоторых участках и к фосфорилированию дополнительных сайтов, которые называются патологические сайты фосфорилирования. Тем не менее, существует перекрытие между БА и здоровых взрослых моделей фосфорилирования, несмотря на количественные различия в уровне ^4. Как специфические события фосфорилирования влияние функции и дисфункции Tau остается в значительной степени неизвестны. Мы стремимся, чтобы расшифровать регулирование Tau с помощью PTMs на молекулярном уровне.

Для того, чтобы углубить понимание молекулярных аспектов Tau, мы должны решать технические проблемы. Во-первых, Tau является внутренне неупорядоченным белком (IDP), когда выделен в растворе. Такие белки не имеют четко определенную трехмерную структуру, в физиологических условиях и требуют особого биофизических методов для изучения их функции (ы) и структурные свойства. Tau является парадигмой для растущего класса ВПЛ, часто ассоциированы спатологии, такие как нейродегенеративные заболевания, тем самым увеличивая интерес для понимания молекулярных параметров, лежащих в основе их функций. Во-вторых, характеристика тау фосфорилирования представляет собой аналитический вызов, с 80 потенциальных сайтов фосфорилирования вдоль последовательности длинного 441 аминокислотного Tau изоформы. Ряд антител были разработаны против фосфорилированных эпитопов Tau и используются для обнаружения патологического тау в нейронах или ткани головного мозга. Фосфорилирования события могут происходить по крайней мере 20 сайтов, направленных на пролина-направленного киназ, большинство из них в непосредственной близости в пределах Proline богатых региона. Качественные (какие сайты?) И количественный (что стехиометрии?) Характеристика трудно даже самых последних методов MS ^5.

ЯМР-спектроскопии может быть использован для исследования неупорядоченные белки, которые являются высоко динамические системы состоят из ансамблей конформеров. Высокое разрешение ЯМР-спектроскопии была примеред исследовать как структуру и функцию белка тау. Кроме того, сложность профиля фосфорилирования Тау привела к разработке молекулярных инструментов и новых методов анализа с помощью ЯМР для идентификации сайтов фосфорилирования ^{6 – 8.} ЯМР в качестве аналитического метода позволяет для идентификации сайтов фосфорилирования тау в глобальной манере, визуализация всех модификаций одноузельных в одном эксперименте, и количественной оценки степени фосфатного включения. Эта точка имеет важное значение, так как хотя фосфорилирования исследования по Tau изобилуют в литературе, большинство из них были выполнены с антителами, в результате чего большая степень неопределенности в течение полного профиля фосфорилирования и, таким образом, истинное влияние отдельных событий фосфорилирования. Рекомбинантные киназ, включая ПВА, гликоген-синтазы-киназы (3 & beta Gsk3β), Циклинзависимые киназы 2 / циклин A (CDK2 / СусА), циклин-зависимая киназа 5 (CDK5) / p25 актivator белок, внеклеточный-сигнал-регулируемой киназы 2 (ERK2) и микротрубочки сродства для регулирования киназы (МАРК), которые показывают активность фосфорилирования по отношению к Tau, могут быть получены в активной форме. Кроме того, мутанты Tau, которые позволяют генерировать специфические тау-белка изоформы с хорошо охарактеризованных узорами фосфорилирования используются для расшифровки фосфорилирования код Tau. ЯМР – спектроскопия затем используется для характеристики ферментативно модифицированных образцов Tau ^{6 – 8.} Хотя в пробирке фосфорилирование тау является более сложным , чем псевдо-фосфорилирования , например, путем мутации выбранного Ser / Thr в глутаминовой кислоты (Glu) остатков, такой подход имеет свои преимущества. Действительно, ни структурные параметры воздействия, ни взаимодействия фосфорилирования всегда может быть имитируется глутаминовой кислот. Примером может служить поворот мотив наблюдается вокруг фосфосерина 202 (pSer202) / фосфотреонина 205 (pThr205), который не воспроизводится с Glu ⁹ мутаций.

<p claсс = "jove_content"> Здесь подготовка изотопно меченых Tau для ЯМР исследований будут описаны в первую очередь. Тау-белок фосфорилируется ERK2 модифицируется на многочисленных сайтах, описанных как патологические сайты фосфорилирования, и, таким образом, представляет собой интересную модель гиперфосфорилированного Tau. Подробный протокол Tau в пробирке фосфорилирования рекомбинантной ERK2 киназы представлена. ERK2 активируется фосфорилированием митогеном активируемой протеинкиназы / ERK киназ (МЕК) ^{10 – 12.} В дополнение к подготовке модифицированного, меченные изотопами тау-белок, стратегия ЯМР используется для идентификации PTMs описана.