JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
, , , , , , , , , , , ,
1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה -21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון 1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה.

יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated 2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר 3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה 4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית.

כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות 5.

ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון 6 – 8. תמ"ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25 חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically 6 – 8. למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות 9.

<p class = "jove_content"> כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) 10 – 12. בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

Protocol

1. ייצור של 15 N, 13 C-טאו (איור 1) Transform פלסמיד ביטוי T7 רקומביננטי pET15b-טאו 13,14 לתוך BL21 (DE3) תאים חיידקיים המוסמכות coli Escherichia 15. הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך (441 שאריות חומצת אמינו) הוא מש…

Representative Results

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג'ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג'ל…

Discussion

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי ז?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyIntrinsically Disordered ProteinsTau ProteinPhosphorylationMolecular RegulationDiseaseProtein InteractionProtein StructureProtein FunctionAPtc VirusTherapyProtein InhibitorsBL21 CellsPlasmid DNALuria Bertani MediumAmpicillinM9 MediumIsotope LabelingRecombinant PlasmidOptical Density

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image