Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Een van de belangrijkste uitdagingen van de gezondheidszorg in de ^21e eeuw zijn neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Tau is een microtubule-geassocieerde eiwit dat microtubulusvorming (MT) stimuleert. Tau is eveneens betrokken bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zogenaamde tauopathieën, waarvan de bekendste is AD. In deze aandoeningen, is Tau self-aggregaten in gepaarde spiraalvormige filamenten (PHF) en vond gewijzigd op vele residuen door posttranslationele modificaties (PTMs), zoals fosforylering ^1. Fosforylering van tau-eiwit is betrokken bij zowel de regulering van de fysiologische functie van MT stabilisatie en pathologische verlies van functie die AD neuronen kenmerkt.

Bovendien Tau eiwit, indien geïntegreerd in PHF's bij zieke neuronen, onveranderlijk hypergefosforyleerd ^2. In tegenstelling tot normale Tau dat 2-3 fosfaatgroepen bevat, de hypergefosforyleerde Tau in PHF's bevat 5-9 Phosphate ³ groepen. Hyperfosforylering van Tau overeen zowel met een stijging van stoichiometrie bij sommige sites en fosforylering van extra sites die pathologische plaatsen van fosforylering worden genoemd. Er bestaat echter overlapping tussen AD en normale volwassen patronen van fosforylering, ondanks kwantitatieve verschillen in het niveau ^4. Hoe specifiek fosforylering gebeurtenissen invloed functie en disfunctie van Tau blijft grotendeels onbekend. Wij streven ernaar om Tau regelgeving ontcijferen door PTMs op moleculair niveau.

Om het begrip van de moleculaire aspecten van Tau verdiepen, we moeten technische uitdagingen aan te pakken. Ten eerste, Tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) als geïsoleerd in oplossing. Dergelijke eiwitten missen welomschreven driedimensionale structuur onder fysiologische omstandigheden en vereisen specifieke biofysische methoden om hun functie (s) en structurele eigenschappen te bestuderen. Tau is een paradigma voor de groeiende klasse van ontheemden, vaak geassocieerd metaandoeningen zoals neurodegeneratieve ziekten, vandaar toenemend belang om de moleculaire randvoorwaarden die hun functie te begrijpen. Ten tweede karakterisering van Tau fosforylering is een analytische uitdaging, met 80 mogelijke fosforylatieplaatsen plaatsen langs de sequentie van de langste 441 aminozuur Tau isovorm. Een aantal antilichamen ontwikkeld tegen gefosforyleerde epitopen van tau en worden gebruikt voor detectie van pathologische tau in neuronen of hersenweefsel. Fosforylering evenementen kunnen plaatsvinden op ten minste 20 locaties doelwit van-proline gerichte kinases, de meeste van hen in de buurt binnen de Proline-rijke regio. De kwalitatieve (welke sites?) En kwantitatieve (wat stoichiometrie?) Karakterisering is moeilijk, zelfs door de meest recente MS-technieken ^5.

NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om ontvouwen eiwitten die sterk dynamische systemen samengesteld uit ensembles conformeren zijn onderzoeken. Hoge-resolutie NMR-spectroscopie was toepased zowel structuur en functie van het tau-eiwit te onderzoeken. Bovendien, de complexiteit van Tau fosforylering profiel geleid tot de ontwikkeling van moleculaire technieken en nieuwe analysemethoden via NMR voor het identificeren van fosforylatieplaatsen ^6-8. NMR als een analytische methode het identificeren van tau fosforylatieplaatsen op algemene wijze, visualisatie van de single-site modificaties in één experiment en kwantificering van de mate van Fosfaatopname. Dit punt is van essentieel belang, omdat hoewel fosforylering studies op Tau in overvloed in de literatuur, de meeste van hen zijn uitgevoerd met antilichamen, waardoor een grote mate van onzekerheid over de volledige profiel van fosforylering en daarmee de werkelijke impact van individuele fosforylering gebeurtenissen. Recombinant kinasen waaronder PKA, glycogeen-synthase kinase 3β (GSK3ß), Cycline-afhankelijke kinase 2 / cycline A (CDK2 / CycA), Cycline-afhankelijke kinase 5 (CDK5) / p25 activator eiwitten, extracellulaire signaalgereguleerde kinase 2 (ERK2) en microtubule-affiniteit-regulerende kinase (MARK), waarbij fosforylatie activiteit ten opzichte Tau vertonen, kunnen worden bereid in een actieve vorm. Bovendien worden Tau mutanten die het mogelijk maken de gerichte Tau proteïne isovormen met goed gekarakteriseerde fosforylering patronen die de fosforylering van Tau code ontcijferen. NMR spectroscopie wordt vervolgens gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters ⁶ karakteriseren ^{– 8.} Hoewel in vitro fosforylering van Tau is moeilijker dan pseudo-fosforylatie zoals door mutatie van geselecteerde Ser / Thr in glutaminezuur (Glu) residuen, deze aanpak heeft zijn voordelen. Inderdaad, noch de structurele gevolgen noch wisselwerkingsparametingen van fosforylatie altijd worden nagebootst door glutaminezuur. Een voorbeeld is de turn motief waargenomen rond 202 fosfoserine (pSer202) / fosfothreonine 205 (pThr205), die niet is weergegeven door Glu mutaties ^9.

<p class = "jove_content"> Hier is de bereiding van een isotoop gemerkte Tau voor NMR studies worden eerst beschreven. Tau-eiwit gefosforyleerd door ERK2 wordt gewijzigd op tal van sites beschreven als pathologische plaatsen van fosforylering, en dus een interessant model van gehyperfosforyleerd Tau vertegenwoordigt. Een gedetailleerd protocol van Tau in vitro fosforylering door recombinant ERK2 kinase wordt gepresenteerd. ERK2 wordt geactiveerd door fosforylering door mitogeen geactiveerde proteïne kinase / ERK kinase (MEK) ^10-12. Naast de bereiding van gemodificeerde, isotopisch gemerkte Tau-eiwit, is de NMR strategie voor de identificatie van de PTMs beschreven.