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Biochemistry

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
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1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

21世紀の医療の主な課題の1つは、アルツハイマー病（AD）などの神経変性疾患です。タウは、微小管（MT）の形成を刺激する微小管結合タンパク質です。タウは、最もよく知られている、いわゆるタウオパチーは、ADである、いくつかの神経変性疾患においても同様に関与しています。これらの疾患では、タウ対らせん状フィラメント（たPHF）で自己集合体とは、リン酸化の1のような翻訳後修飾（PTMを）により、多くの残基に変更された発見されました。タウタンパク質のリン酸化は、MTの安定化とADの神経細胞を特徴付ける関数の病理学的喪失のその生理学的機能の両方の調節に関与しています。

また、病気のニューロンでのPHFに統合タウタンパク質は、必ず2を過剰リン酸化されています。 2-3リン酸基を含んでいる通常のタウとは異なり、のPHF中の過リン酸化タウは、5から9 phosphatが含まれていますe基3。タウの過剰リンは、いくつかのサイトでの化学量論の増加におよびリン酸化の病理学的部位と呼ばれる追加の部位のリン酸化の両方に対応しています。しかし、オーバーラップはレベル4で量的な違いにもかかわらず、ADおよびリン酸化の正常な成人のパターンとの間に存在します。タウのどの特定のリン酸化事象の影響関数と機能障害はほとんど不明のまま。私たちは、分子レベルでのPTMによってタウ規制を解読することを目指しています。

タウの分子的側面の理解を深めるために、我々は技術的な課題に対処する必要があります。まず、タウは、溶液中で単離された本質的に無秩序なタンパク質（IDP）です。そのようなタンパク質は、生理学的条件下で十分に定義された三次元構造を欠き、その機能（複数可）および構造的特性を研究するために、特定の生物物理学的方法を必要とします。タウは、多くの場合、関連付けられた発見、国内避難民の成長クラスのパラダイムであります神経変性疾患のような病理は、したがって、それらの機能の基礎となる分子パラメータを理解するために関心が高まっ。第二に、タウのリン酸化の特徴付けは最長441アミノ酸のタウアイソフォームの配列に沿って80の潜在的なリン酸化部位で、分析的な課題です。抗体の数は、タウのリン酸化されたエピトープに対して開発されており、ニューロンまたは脳組織中の病理学的タウの検出のために使用されます。リン酸化事象は、プロリンに富む領域内に近接して、プロリン指向性キナーゼによって標的と少なくとも20のサイトにそれらのほとんどを行うことができます。定性（どのサイト？）および定量的（どの化学量論？）キャラクタリゼーションは、最も最近のMS技術5により困難です。

NMR分光法は、配座のアンサンブルから構成される非常に動的なシステムである無秩序なタンパク質を研究するために使用することができます。高分解能NMR分光法は、アプリましたタウタンパク質の構造と機能の両方を調査するために編。 8 –また、タウのリン酸化プロファイルの複雑性は、リン酸化部位6を識別するためのNMRを使用して分子ツール、新しい分析法の開発につながりました。分析方法としてNMRは、リン酸取り込みの程度の全体的な方法で、タウのリン酸化部位の同定、単一の実験内のすべての単一サイトの変更の可視化、定量化を可能にします。タウ上のリン酸化研究は文献にあふれているが、それらのほとんどは、リン酸化の完全なプロファイルの不確実性の大きな程度のため、個々のリン酸化事象の真のインパクトを残して、抗体を用いて行われてきたので、この点は必須です。 PKA、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）、サイクリン依存性キナーゼ2 /サイクリンA（CDK2 / CycA）、サイクリン依存性キナーゼ5（CDK5）/ P25の行為を含む組換えキナーゼタウ向かっリン酸化活性を示すivatorタンパク質、細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）と微小管親和性調節キナーゼ（MARK）は、活性形態で調製することができます。また、十分に特徴付けられたリン酸化パターンと特定のタウタンパク質アイソフォームの生成を可能にするタウ変異体は、タウのリン酸化のコードを解読するために使用されます。 8 – NMR分光法は次に酵素的に修飾されたタウのサンプル6を特徴付けるために使用されます。タウのin vitroリン酸化は、このようなグルタミン酸（Gluの）残基に選択されたセリン/スレオニンの変異などによって擬似リン酸化よりも困難ではあるが、このアプローチは、そのメリットがあります。実際に、リン酸化のいずれも構造的な影響も相互作用パラメータは、常にグルタミン酸によって模倣することができます。例では、Gluの突然変異9で再現されていないホスホセリン202（pSer202）の周りに観察ターンモチーフ/ホスホトレオニン205（pThr205）、です。

<p claSS = "jove_content">ここで、NMR調査のための同位体標識されたタウの調製は、最初に説明します。 ERK2によってリン酸化タウタンパク質は、リン酸化の病理学的部位として説明多数のサイト上で修正、したがって、過リン酸化タウの興味深いモデルを表しています。組換えERK2キナーゼによるインビトロでのリン酸化のタウの詳細なプロトコルが提示されています。 12 – ERK2は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/ ERKキナーゼ（MEK）10によるリン酸化によって活性化されます。修飾された、同位体標識されたタウタンパク質の調製に加えて、のPTMの同定のために使用されるNMR戦略が記載されています。

Protocol

15 N、13 C-タウ（図1）の1.生産 BL21にをpET15b-タウ組換えT7発現プラスミド13,14を変換（DE3）コンピテント大腸菌細菌細胞15。 注：最長（441アミノ酸残基）タウアイソフォームをコードするcDNAは、たpET15bプラスミド中にNcoIおよびXhoI制限部位の間にクローニングされています。 有能BL21 1.5ミリリットルのプラスチックチューブ…

Representative Results

図3Aは、溶出勾配の間に観察された280nmの主要な吸収ピークを示します。クロマトグラム以上のアクリルアミドゲル上で見られるように、このピークは、精製されたタウタンパク質に相当します。 図3Bは、タンパク質の脱塩が効率的であることを確認して、280 nmおよび導電率のピーク時によく分離吸収ピークを示しています。 図4は、タンパク質のSDS-PAGE分析により、複?…

Discussion

私たちは、酵素的に修飾タウサンプルを特徴づけるためにNMR分光法を使用しています。全長ヒトタウタンパク質のためにここに記載の組換え発現および精製は、同様に変異タウまたはタウドメインを生成することができます。同位体濃縮されたタンパク質は、組換え発現を必要とする、NMR分光法のために必要とされます。リン酸化部位の同定は、共鳴の割り当てと15 N、13 C二?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
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References

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
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