JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
, , , , , , , , , , , ,
1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

21. yüzyılda sağlık temel güçlüklerden biri gibi Alzheimer hastalığı (AH) gibi nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Tau mikrotübül (MT) oluşumunu teşvik eden bir mikrotübüle bağlı proteindir. Tau eşit çeşitli nörodejeneratif hastalıkların iyi bilinen AD olduğu sözde tauopatıler, yer almaktadır. Bu hastalıklarda, Tau çiftlenmiş helezon şeklinde lifler (PHF'ler) kendine gruplar ve fosforilasyon 1 ile posttranslasyonel modifikasyonlar (PTMS) birçok kalıntıları modifiye bulunur. Tau proteininin fosforilasyonu MT stabilizasyonu AD nöronları karakterize fonksiyon patolojik kaybı fizyolojik fonksiyonun iki düzenlenmesinde implike edilmektedir.

Hastalıklı nöronların PHF'lerin entegre Dahası, Tau proteini, kaçınılmaz 2 hiperfosforilatlandırılmaya edilir. 2-3 fosfat gruplarını içeren normal Tau aksine, PHF'lerin içinde hiperfosforilize Tau 5-9 Phosphat içeriyorE grupları, 3. Tau hiperfosforizasyon'un bazı bölgelerde ve fosforilasyon patolojik sitesi olarak adlandırılan ek yerleriyle fosforilasyonuna stokiyometri artışa hem de karşılık gelir. Ancak, üst üste seviye 4 nicel farklılıklara rağmen, AD ve fosforilasyon normal erişkin modelleri arasında var. Nasıl özel fosforilasyon olayları etkisi fonksiyonu ve Tau disfonksiyon büyük ölçüde bilinmemektedir. Biz, moleküler düzeyde PTMS tarafından Tau düzenleme deşifre hedefliyoruz.

Tau moleküler yönlerini anlayışı derinleştirmek için, teknik zorlukların üstesinden gelmek için var. İlk olarak, Tau çözelti içinde yalıtılmış bir içsel düzensiz protein (IDP) 'dir. Bu tür proteinler, fizyolojik koşullar altında, iyi tanımlanmış üç boyutlu bir yapıya sahip olmaması ve fonksiyon (lar) ve yapısal özelliklerini incelemek için, özellikle biyo-fiziksel yöntemler gerektirir. Tau yerinden edilmiş kişilerin artan sınıf için bir paradigma olduğunu sık sık ilişkili bulunduBöyle nörodejeneratif hastalıklar gibi patolojiler, bu nedenle görevlerini altında yatan moleküler parametreleri anlamak için ilgi artmaktadır. İkincisi, Tau fosforilasyonu karakterizasyonu uzun 441 amino asit Tau izoformunun dizisi boyunca 80 potansiyel fosforilasyon siteleri ile, bir meydan okumadır. Antikorların bir dizi Tau fosforile epitoplarına karşı geliştirilmiş ve nöronlar ve beyin dokusunda patolojik tau saptanması için kullanılır. Fosforilasyon olayları Proline zengin bölgede yakın çoğu prolin-yönelimli kinazlar tarafından hedef en az 20 sitelerinde yer alabilir. Nitel (hangi sitelerin?) Ve (Ne stoikiometri?) Kantitatif karakterizasyonu bile en son MS teknikleri 5 tarafından zordur.

NMR spektroskopisi çok konformerlerin topluluklar oluşturduğu dinamik sistemlerdir düzensiz proteinleri araştırmak için kullanılabilir. Yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi başvurunun oldued Tau proteini hem yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için. 8 – Buna ek olarak, Tau fosforilasyon profilinin karmaşıklığı fosforilasyon 6 tanımlanması için NMR kullanılarak moleküler araçlar ve yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. bir analitik yöntemin NMR fosfat dahil ölçüde küresel bir şekilde Tau fosforilasyon tanımlanması, tek bir deneyde, tüm tek-mevkili modifikasyonlarının görselleştirme ve miktar tayini için izin verir. Tau üzerinde fosforilasyon Literatürde bol birlikte, çoğu fosforilasyonu profilinin tamamı üzerinde bir belirsizlik geniş çapta ve böylece tek tek fosforilasyon olaylarının gerçek etkisini bırakarak antikorlar ile gerçekleştirilmiştir için bu husus çok önemlidir. PKA, Glikojen-sentaz kinaz 3p (GSK3), sikline bağımlı kinaz 2 / siklin A (CDK2 / CycA), sikline bağlı kinaz 5 (CDK5) / p25 eylemi içeren rekombinant kinazlarTau doğru fosforlaştırma etkinliği görülür ivator proteini, hücre dışı sinyal ile düzenlenen kinaz 2 (ERK2) ve mikrotübül-afinite düzenleyici kinaz (Mark), bir aktif formda hazırlanabilir. Buna ek olarak, iyi karakterize edilmiş fosforilasyon desen belirli bir Tau proteini izoformlarının üretilmesi için izin Tau mutantları tau'nun fosforilasyonu kodunu çözmek için kullanılır. 8 – NMR spektroskopisi, sonra enzimatik olarak modifiye edilmiş Tau örnekleri 6 karakterize etmek için kullanılır. Tau in vitro fosforilasyonu glutamik asit (Glu) kalıntıları seçilen Ser / Thr mutasyon ile olduğu gibi sözde fosforilasyon daha zor olmasına rağmen, bu yaklaşım da yararları vardır. Gerçekten de, fosforilasyon, ne yapısal etkisi de etkileşim parametreler her zaman glutamik asit ile taklit edilebilir. Bir örnek Glu mutasyonları 9 ile yeniden değildir fosfoserin 202 (pSer202) etrafında gözlenen dönüş motifi / fosfotreonin 205 (pThr205) 'dir.

<p claP = "jove_content"> Burada, NMR incelemeleri için izotopik olarak etiketlenmiş Tau hazırlanması ilk olarak tarif edilecektir. ERK2 tarafından fosforile tau proteini fosforilasyon patolojik siteler olarak tanımlanan çok sayıda sitelerde modifiye ve böylece hiperfosforillenmiş Tau ilginç bir model temsil eder. Rekombinant ERK2 kinaz tarafından in vitro fosforilasyonuna Tau ayrıntılı bir protokol verilmektedir. 12 – ERK2 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz / ERK kinaz (MEK) 10 ile fosforilasyonu ile aktif hale gelir. değiştirilirse izotopik olarak etiketlenmiş tau proteininin hazırlanmasına ek olarak, PTMS tespit etmek için kullanılan NMR stratejisi açıklanmaktadır.

Protocol

15 N 1. üretimi, 13C-tau (Şekil 1) BL21 pET15b-Tau rekombinant T7 ifade plazmid 13,14 Transform (DE3) Yetkili Escherichia coli bakteri hücreleri 15. Not: en uzun (441 amino asit kalıntıları) Tau izoform cDNA kodlama pET15b plasmidde Ncol ve Xhol sınırlama siteleri arasında klonlanmıştır. Yetkili BL21 1.5 ml'lik plastik bir tüp içinde plasmid DNA, 100 ng plazmid DNA ug başına 1-5 x 10 7 koloni …

Representative Results

Şekil 3A, elüsyon gradyanı gözlenen 280 nm'de büyük bir emilim pik gösterir. kromatogram üzerinde akrilamid jeli üzerinde görüldüğü gibi, bu seviye, saflaştırılmış tau proteininin karşılık gelir. Şekil 3B proteininin tuzsuzlaştırma verimli olmasını sağlamak, 280 nm ve iletkenliği zirvesinde bir iyi ayrılmış emilim pik gösterir. Şekil 4, bir protein, SDS-PAGE analizi ile çok sayıda protein fosforilasyonu 16 karakteristik gözlenen jel shift …

Discussion

Biz enzimatik modifiye Tau örnekleri karakterize etmek NMR spektroskopisi kullandık. Rekombinant sentezleme ve tam boyunda insan tau proteinini burada tarif edilen saflaştırma Benzer mutant tau ya da tau etki üretmek için kullanılabilir. Izotopik olarak zenginleştirilmiş protein, yeniden birleştirici ifade gerektiren NMR spektroskopi için gereklidir. Fosforilasyon alanların belirlenmesi rezonans atama ve 15 N, 13 C çift etiketli protein gerektirir. izotopların maliyeti göz önüne al…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyIntrinsically Disordered ProteinsTau ProteinPhosphorylationMolecular RegulationDiseaseProtein InteractionProtein StructureProtein FunctionAPtc VirusTherapyProtein InhibitorsBL21 CellsPlasmid DNALuria Bertani MediumAmpicillinM9 MediumIsotope LabelingRecombinant PlasmidOptical Density

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image