Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Una delle principali sfide della sanità nel 21 ^° secolo, sono le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD). Tau è una proteina associata ai microtubuli che stimola microtubuli (MT) formazione. Tau è ugualmente coinvolto in diverse malattie neurodegenerative, le cosiddette tauopatie, di cui il più noto è AD. In questi disturbi, Tau auto-aggregati in filamenti elicoidali appaiati (PHFS) e si trova modifica per molti residui di modificazioni post-(PTM), come la fosforilazione ^1. La fosforilazione della proteina tau è implicata nella regolazione sia della sua funzione fisiologica di stabilizzazione MT e la perdita patologica di funzione che caratterizza i neuroni AD.

Inoltre, la proteina Tau, se integrato in PHFS nei neuroni malati, è invariabilmente hyperphosphorylated ^2. A differenza di Tau normale che contiene 2-3 gruppi fosfato, il Tau iperfosforilata in PHFS contiene 5-9 Phosphate gruppi ^3. Iperfosforilazione di Tau corrisponde sia ad un aumento della stechiometria in alcuni siti e fosforilazione di altri siti che sono chiamati siti patologici di fosforilazione. Tuttavia, esiste sovrapposizione tra AD e modelli normali adulti di fosforilazione, nonostante le differenze quantitative nel livello ^4. Come specifica eventi di fosforilazione funzione di influenza e la disfunzione di Tau rimane in gran parte sconosciuta. Il nostro obiettivo è di decifrare regolamento Tau dal PTM a livello molecolare.

Per approfondire la comprensione degli aspetti molecolari di Tau, dobbiamo affrontare sfide tecniche. In primo luogo, è una proteina Tau intrinsecamente disordinati (IDP) quando isolato in soluzione. Tali proteine ​​mancano ben definita struttura tridimensionale in condizioni fisiologiche e richiedono particolari metodi biofisici per studiare la funzione (s) e le proprietà strutturali. Tau è un paradigma per la crescente classe degli sfollati, che spesso si trovano associatopatologie quali le malattie neurodegenerative, aumentando così l'interesse per comprendere i parametri molecolari sottostanti le loro funzioni. In secondo luogo, la caratterizzazione di Tau fosforilazione è una sfida analitica, con 80 potenziali siti di fosforilazione lungo la sequenza più lunga 441 amminoacidi Tau isoforma. Un certo numero di anticorpi sono stati sviluppati contro epitopi fosforilate di Tau e sono utilizzati per il rilevamento di proteina tau nei neuroni o tessuto cerebrale. eventi di fosforilazione possono avvenire su almeno 20 siti presi di mira da chinasi prolina-diretto, la maggior parte dei quali in prossimità nella regione ricca di prolina. La qualitativo (quali siti?) E quantitativa (cosa stechiometria?) Caratterizzazione è difficile anche dalle più recenti tecniche di MS ^5.

spettroscopia NMR può essere usato per studiare le proteine ​​disordinate che sono altamente sistemi dinamici costituiti da gruppi di conformeri. spettroscopia NMR ad alta risoluzione è stato appliEd a indagare sia la struttura e la funzione della proteina Tau. Inoltre, la complessità del profilo fosforilazione di Tau ha portato allo sviluppo di strumenti molecolari e nuovi metodi analitici utilizzando NMR per l'identificazione dei siti di fosforilazione ^{6 – 8.} NMR come metodo analitico consente l'identificazione dei siti di fosforilazione Tau in modo globale, visualizzazione di tutte le modifiche single-site in un singolo esperimento, e la quantificazione del grado di incorporazione di fosfato. Questo punto è essenziale in quanto, anche se gli studi di fosforilazione di Tau abbondano nella letteratura, la maggior parte di loro sono stati eseguiti con anticorpi, lasciando un ampio margine di incertezza sul profilo completo di fosforilazione e quindi il vero impatto di singoli eventi di fosforilazione. chinasi ricombinanti tra PKA, glicogeno-sintasi chinasi 3β (Gsk3β), ciclina-dipendente chinasi 2 / ciclina A (CDK2 / CYCA), ciclina-dipendente chinasi 5 (CDK5) / p25 attoproteine ​​ivator, extracellulare segnale-regolate chinasi 2 (ERK2) e microtubuli-affinità di regolazione chinasi (MARK), che mostrano l'attività fosforilazione verso Tau, possono essere preparati in una forma attiva. Inoltre, Tau mutanti che permettono per la generazione di specifiche isoforme della proteina Tau con i modelli di fosforilazione ben caratterizzati sono utilizzati per decifrare il codice di fosforilazione di Tau. Spettroscopia NMR viene quindi utilizzato per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati ^{6 – 8.} Anche se in vitro fosforilazione di Tau è più impegnativo di pseudo-fosforilazione come per mutazione di selezionati Ser / Thr in residui di acido glutammico (Glu), questo approccio ha i suoi meriti. Infatti, né i impatto né di interazione parametri strutturali di fosforilazione possono sempre essere imitato da acidi glutammico. Un esempio è il motivo turno osservato intorno fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), che non è riprodotto con Glu mutazioni ^9.

<p class = "jove_content"> Qui, la preparazione di isotopicamente marcato Tau per indagini NMR verrà descritto prima. proteina tau fosforilata da ERK2 viene modificato su numerosi siti descritti come siti patologiche di fosforilazione, e rappresenta quindi un interessante modello di Tau hyperphosphorylated. Un protocollo dettagliato di Tau in fosforilazione vitro da ricombinante ERK2 chinasi è presentato. ERK2 viene attivata dalla fosforilazione da mitogeni activated protein chinasi / ERK chinasi (MEK) ^{10 – 12.} Oltre alla preparazione di modificato, proteina Tau isotopicamente marcati, la strategia NMR utilizzato per l'identificazione del PTM è descritto.