Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Eine der wichtigsten Herausforderungen der Gesundheitsversorgung im ^21. Jahrhundert sind neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer – Krankheit (AD). Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das Mikrotubuli (MT) Bildung stimuliert. Tau gleichmäßig in mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, sogenannte Tauopathien, von denen die bekannteste AD ist. In dieser Erkrankungen, Tau Selbst Aggregate in gepaarte helikale Filamente (PHFs) und fand bei vielen Reste durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung ¹ modifiziert ist. Die Phosphorylierung des Tau-Proteins ist in beiden Regulation seiner physiologischen Funktion von MT Stabilisierung und pathologische Verlust der Funktion impliziert, dass AD-Neuronen charakterisiert.

Weiterhin Tau – Protein, wenn in PHFs in erkrankten Neuronen integriert wird ausnahmslos ² hyperphosphoryliert. Im Gegensatz zu normalen Tau, die 2-3 Phosphatgruppen enthält, enthält die hyperphosphorylated Tau in PHFs 5 bis 9 phosphate Gruppen ^3. Hyperphosphorylierung von Tau entspricht sowohl zu einer Erhöhung der Stöchiometrie an einigen Standorten und zur Phosphorylierung von zusätzlichen Stellen, die pathologische Websites der Phosphorylierung genannt werden. Allerdings Überlappung besteht zwischen AD und normalen erwachsenen Muster der Phosphorylierung trotz quantitative Unterschiede in der Ebene ^4. Wie spezifische Phosphorylierungsereignisse Einflussfunktion und Dysfunktion von Tau bleibt weitgehend unbekannt. Wir zielen darauf ab Tau Regulierung durch PTM auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.

Um das Verständnis der molekularen Aspekte der Tau zu vertiefen, müssen wir technische Herausforderungen zu bewältigen. Erstens ist Tau ein intrinsisch ungeordneten Protein (IDP), wenn in der Lösung isoliert. Solche Proteine ​​fehlen wohldefinierte dreidimensionale Struktur unter physiologischen Bedingungen und insbesondere biophysikalischen Methoden benötigen, um ihre Funktion (en) und strukturellen Eigenschaften zu studieren. Tau ist ein Paradigma für die wachsende Klasse von IDPs, fand oft im Zusammenhang mitKrankheiten wie neurodegenerative Erkrankungen, die Erhöhung somit das Interesse der molekularen Parameter zugrunde liegenden ihre Funktionen zu verstehen. Zweitens Charakterisierung von Tau-Phosphorylierung ist ein analytisches Herausforderung mit 80 potentiellen Phosphorylierungsstellen entlang der Sequenz des längsten 441 Aminosäure-Tau-Isoform. Eine Anzahl von Antikörpern wurden gegen phosphorylierte Epitope von Tau entwickelt und werden für den Nachweis von pathologischen Tau in Neuronen oder Hirngewebe verwendet. Phosphorylierungsereignisse stattfinden kann auf mindestens 20 Seiten gezielt durch Prolin-gerichtete Kinasen, die meisten von ihnen in der Nähe in der Prolin-reiche Region. Die qualitative (welche Seiten?) Und quantitative (welche Stöchiometrie?) Charakterisierung ist schwierig , auch durch die jüngsten MS – Techniken ^5.

NMR-Spektroskopie kann verwendet werden, ungeordnete Proteine ​​zu untersuchen, sind hochdynamische Systeme von Ensembles von Konformeren gebildet. Hochauflösende NMR-Spektroskopie war Anwened sowohl Struktur als auch Funktion des Tau-Proteins zu untersuchen. Darüber hinaus führte die Komplexität der Tau – Phosphorylierung des Profils auf die Entwicklung von molekularen Werkzeugen und neue Analyseverfahren unter Verwendung von NMR zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen ^{6 – 8.} NMR als analytisches Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Tau Phosphorylierungsstellen in einer globalen Weise Visualisierung aller Single-Site-Modifikationen in einem einzigen Experiment, und Quantifizierung des Ausmaßes der Phosphat-Inkorporation. Dieser Punkt ist wichtig, da, obwohl die Phosphorylierung Studien über Tau in der Literatur gibt es zuhauf, die meisten von ihnen wurden mit Antikörpern durchgeführt wurde, ein hohes Maß an Unsicherheit über die gesamte Profil der Phosphorylierung verlassen und damit die tatsächlichen Auswirkungen der einzelnen Phosphorylierungsereignisse. Rekombinante Kinasen einschließlich PKA, Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3 & bgr;), Cyclin-abhängige Kinase 2 / Cyclin A (CDK2 / CycA), Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) / p25 Aktivator Protein, extrazelluläre-signal-regulated kinase 2 (ERK2) und Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase (MARK), die in Richtung Tau-Phosphorylierung Aktivität zeigen, können in aktiver Form hergestellt werden. Darüber hinaus Tau-Mutanten, die zur Erzeugung von spezifischen Tau-Protein-Isoformen mit gut charakterisierten Phosphorylierungsmuster ermöglichen, werden verwendet, um die Phosphorylierung Code von Tau zu entziffern. NMR – Spektroskopie wird dann Proben zu charakterisieren enzymatisch modifizierten Tau verwendet , ^{6 bis 8.} Obwohl in vitro Phosphorylierung von Tau schwieriger als Pseudo-Phosphorylierung wie durch Mutation von ausgewählten Ser / Thr in Glutaminsäure (Glu) Resten ist, hat dieser Ansatz seine Vorzüge. Tatsächlich sind weder die strukturellen Auswirkungen noch Wechselwirkungsparameter der Phosphorylierung kann immer durch Glutaminsäure nachgeahmt werden. Ein Beispiel ist das wiederum Motiv um Phosphoserin 202 (pSer202) beobachtet / Phosphothreonin 205 (pThr205), die mit Glu Mutationen ⁹ nicht wiedergegeben wird.

<p class = "jove_content"> Hier wird die Herstellung von isotopenmarkierten Tau für NMR-Untersuchungen wird zuerst beschrieben. Tau-Protein durch ERK2 phosphoryliert wird auf zahlreichen Standorten als pathologisch Websites der Phosphorylierung beschrieben modifiziert und stellt somit ein interessantes Modell von hyperphosphorylated Tau. Ein detailliertes Protokoll von Tau in vitro – Phosphorylierung durch rekombinante ERK2 – Kinase vorgestellt. ^{12 –} ERK2 durch Phosphorylierung von MAP-Kinase-Weg / ERK – Kinase (MEK) ¹⁰ aktiviert. Zusätzlich zur Herstellung von modifizierten, isotopenmarkierte Tau-Protein, die Strategie zur Identifizierung des PTMs verwendet NMR beschrieben.