Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

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Biochemistry

Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

Determinare la struttura di una biomolecola è un prerequisito chiave per comprendere la sua funzione. Due metodi consolidati per la determinazione della struttura sono la microscopia crio-elettroni e raggi X cristallografia ^{^1,} ^2. Oggi, entrambi i metodi forniscono alta risoluzione informazioni strutturali con risoluzione fino al livello angstrom. Questi due metodi sono stati ampiamente utilizzati per chiarire la struttura di grandi biomolecole come complessi proteici. Anche se i metodi esistenti sono costantemente state migliorate nel corso degli ultimi decenni, la complessità delle strutture biologiche pone ancora una sfida importante per la biologia strutturale, in particolare quando le grandi, dinamiche e transitori complessi sono indagati ^3.

Al fine di studiare le dinamiche di complessi macromolecolari e il rapporto struttura-funzione, in particolare, le metodologie a singola molecola hanno provided informazioni utili ^4. Diverse nuove strategie sono state sviluppate fornendo un approccio ortogonale di acquisire informazioni strutturali e dinamiche. Esempi sono ad alta velocità AFM ^5, manipolazione meccanica ^6, a fluorescenza localizzazione microscopia a ^7, così come singola molecola trasferimento di energia per risonanza (smFRET) ^{^8,} ^9. Da molto presto FRET è stato definito un righello molecolare, a causa della dipendenza distanza sulla scala di lunghezza di biomacromolecole ^10.

Uno particolarmente interessante applicazione smFRET è quello di utilizzare le informazioni distanza ottenuta da misurazioni smFRET dedurre informazioni ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ¹⁵ strutturale </sup^>, ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. Grazie alla elevata risoluzione temporale del smFRET, la posizione delle parti mobili di una struttura proteica può essere localizzato. Tuttavia, al fine di estrarre informazioni quantitative da dati smFRET importanti parametri di correzione sulle molecole di colorante necessario determinare durante la misura ^24. Con questi fattori di correzione, l'efficienza FRET E _FRET può essere calcolato con la formula

,

dove _A e _D </sub> sono le intensità di fluorescenza del donatore e la molecola accettore, rispettivamente (vedere Figura 2). I conti β-fattore per il cross-talk, la fuoriuscita di emissione del donatore nel canale accettore ed è calcolato

dove _'A e I' _d sono le intensità di fluorescenza del donatore e la molecola accettore dopo fotobleaching della molecola accettore.

La γ-fattore corregge la differenza in termini di efficienza di rilevazione relativi nei due canali nonché le differenze nel rendimento di fluorescenza quantica del donatore e il colorante accettore. Si è calcolata da ogni individuo traccia temporale dai

Si noti, che questa descrizione trascura eccitazione diretta della molecola accettore, che talvolta diventa importante e avrebbe bisogno di essere corretto per pure. Per determinare tali fattori di correzione è utile per eccitare sia il donatore e l'accettore in uno schema alternato ²⁵ per distinguere tra i cambiamenti foto-fisiche e dinamiche strutturali.

Al fine di ottenere non solo l'efficienza smFRET quantitativi, ma anche informazioni strutturali quantitative, il sistema Nano-posizionamento (NPS) è stato introdotto nel 2008 ^26. Il nome è stato scelto sulla base delle sue somiglianze con il Global Positioning System basato su satellite (GPS). La NPS è una tecnica ibrida che combina smFRET e X-ray dati cristallografia per la localizzazione di posizioni colorante sconosciuti in complessi biomacromolecular. la cStruttura rystal serve come un quadro di riferimento ei risultati smFRET vengono utilizzati per ottenere informazioni distanza tra una posizione sconosciuta fluoroforo (antenna) e una posizione nota dalla struttura cristallina (satellite). In esperimenti consecutivi le distanze tra l'antenna e diversi satelliti sono misurati e la posizione dell'antenna è determinata mediante un sistema di analisi statisticamente rigoroso basato sulla stima dei parametri bayesiana. Come risultato, non solo la posizione più probabile dell'antenna viene calcolata, ma la sua distribuzione completa incertezza 3D, la cosiddetta posteriori, visualizzata da volumi credibili. Inoltre, NPS è stata ampliata per consentire l'analisi delle reti complete smFRET ^27.

La NPS è stato utilizzato per risolvere un certo numero di importanti questioni trascrizione eucariotico, cioè il corso del DNA monte, il DNA non-modello e l'mRNA nascente all'interno della RNA polimerasi II allungamento complex ^{^12,} ^28, dimostra altresì l'effetto di inizio della trascrizione fattori ²⁶ e l'architettura dinamica di un open-promotore complesso ^29. Inoltre, il NPS è stato utilizzato per chiarire la struttura del archaeal RNA polimerasi complesso aperto ³⁰ e in particolare la posizione del fattore di trascrizione iniziazione TFE, che si lega competitivamente allo stesso sito come fattore di trascrizione allungamento Spt4 / 5 ^31.

Da allora, un certo numero di approcci strutturali basate smFRET state pubblicate ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23. Quando si confrontano diversi metodi strutturali basati smFRET, diventa chiaro che l'apparente precisione del metodo è fortemente dipendente dalla particolare scelta di modelli di tintura. Si deve notare chemolecole di colorante possono presentare comportamento spaziale e orientativo diverso a seconda del loro ambiente locale.

A tal fine, fast-NPS stato introdotto ^32. Fast-NPS utilizza un algoritmo di campionamento advanced riducendo i tempi di calcolo drasticamente. Inoltre, fast-NPS permette di eseguire una analisi strutturale e per ogni molecola di colorante l'utente può scegliere tra una serie di cinque diversi modelli di tintura che verrà descritto in seguito. Il modello più conservativo, chiamato classico, si assume che il colorante occupa solo una, ma sconosciuto, posizione. In questa posizione, il fluoroforo può ruotare liberamente all'interno di un cono, la cui dimensione è determinata dalla rispettiva (dipendente dal tempo) anisotropia di fluorescenza. L'orientamento del cono non è noto, il che porta a grandi incertezze nella conversione efficienze smFRET misurate in distanze. A questo proposito, il modello è conservatore, poiché porterà alla più piccola precisione rispetto alle altre modalità dyeLS. Solo per distanze molto brevi qualora le ipotesi formulate dal piombo modello classico ad una determinazione della posizione notevolmente errato. Per valori tipici smFRET, la posizione corretta è sempre racchiuso nel comparativamente grande volume credibile.

Tuttavia, poiché una maggiore precisione è desiderabile, è importante sviluppare e testare modelli coloranti alternativi, che potrebbe contribuire a migliorare la precisione. Se il colorante gira molto più velocemente rispetto alla durata della fluorescenza intrinseca, il cosiddetto modello iso può essere applicata. Qui, il fattore di orientamento kappa ² (necessario per il calcolo del raggio Förster caratteristica isotropo ) È impostato su 2/3. Come risultato, i volumi credibili calcolate sono quasi due ordini di grandezza inferiore rispetto a quelle del modello classico ^32. Nel caso in cui il fluoroforo si trova in un ambiente che consente non solo reori velocesentazione, ma il movimento in più veloce in tutto il suo volume accessibile, il modello meanpos-iso devono essere utilizzati. In questo modello, il colorante occupa effettivamente solo una posizione media, dove la media spaziale è rappresentato da una conversione distanza polinomio ^15. Questo modello si applica se per esempio il colorante (comunemente idrofobica) è collegata ad una regione idrofila, per esempio, il DNA. Applicazione del modello meanpos-iso comporta un'ulteriore riduzione delle dimensioni dei volumi credibili per un fattore di circa due. Tuttavia, un colorante legata ad una proteina potrebbe legarsi reversibilmente a diverse patch idrofobiche suo volume stericamente accessibile (AV). Un fluoroforo che passa istantaneamente tra queste regioni, ma all'interno di una regione sottoposta a rotazione libera e movimento veloce localizzata è meglio descritta dal modello VAR-meanpos-iso. Per una situazione simile in cui il colorante non è libero di ruotare i VAR-meanpos modello si applica. più d etails su questi modelli si possono trovare nella nostra recente pubblicazione ^32.

Questi modelli offrono un vasto repertorio di conto specifico per i vari ambienti di un colorante potrebbero incontrare e loro applicazione ottimizza saggiamente la sua precisione di localizzazione. In Fast-NPS ogni molecola di colorante attaccato ad una posizione specifica può essere assegnato a un singolo modello, in modo tale che FRET-partner sono autorizzati ad avere modelli diversi. Questo consente la modellazione illimitata e vicino alla natura. Tuttavia, è importante che si compie test statistici rigorosi per garantire che il risultato ottenuto dalla combinazione modello finale è ancora in accordo con i dati sperimentali. Questi test sono inclusi nel software Fast-NPS.

Per applicare Fast-NPS ai dati sperimentali è richiesta la misurazione (solo) tre parametri di input. In primo luogo, il colorante-coppia specifica isotropo Förster raggi (/54782/54782eq5.jpg "/>) Devono essere determinate. Pertanto, la resa quantica (QY) del colorante donatori, gli spettri di emissione di fluorescenza del donatore e lo spettro di assorbimento accettore devono essere misurate. Queste misurazioni possono essere effettuate in bulk, utilizzando uno spettrometro standard ed uno spettrometro a fluorescenza. Per ogni coppia, l'R ₀ viene quindi calcolato utilizzando la PhotochemCAD freeware e può essere usato nell'analisi NPS. Inoltre, il (tempo risolto) anisotropie fluorescenza delle molecole di colorante bisogno essere ottenuti utilizzando una polarizzazione (e tempo) spettrometro di fluorescenza sensibile. Tuttavia, i parametri di input più importanti per fast-NPS sono le efficienze smFRET misurati su una configurazione microscopia a fluorescenza singola molecola, come un microscopio riflessione a fluorescenza interna totale (TIRFM) .

Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per ottenere dati smFRET e l'applicazione di Fast-NPS (Figura 1).

Protocol

1. Prerequisiti e attrezzature di laboratorio NOTA: Il montaggio della camera di misura è illustrato in figura 3. Il sandwich disegno della camera di misura comprende tre componenti principali: un vetrino di quarzo (silice fusa), un film di sigillatura e un coprioggetto che sigilla la camera di flusso. La camera di misura è montato su un supporto campione su misura. Le dimensioni della camera del campione e il supporto di metallo sono orientati per adattarsi ad un vetrino microscopico quarzo standard (76 mm x 26 mm). Cut quarzo vetrini utilizzando una punta di diamante (0,75 millimetri) in posizioni indicate nella figura 4. Il design dei vetrini quarzo è asimmetrica per distinguere tra i due lati di ciascuna diapositiva. NOTA: Le diapositive di quarzo possono essere riutilizzati dopo la misurazione fino a quando la superficie diventa graffiato. Per montare le camere, utilizzare personalizzate portacampioni metallo come illustrato nella figura 5 </ Strong>. I titolari di esempio contengono due fili (M4) per collegare un ingresso ed una tubazione di uscita per la camera di flusso. Inoltre, utilizzare fili (M3) per montare la camera per campioni sul supporto metallico e fili (M3) per fissare il porta-prisma sulla alla metà inferiore del supporto metallico. Eseguire le misurazioni smFRET su un tipo di prisma totale microscopio a fluorescenza a riflessione interna (TIRFM) (Figura 6). NOTA: Il TIRFM presenta tre laser: Un verde (532 nm, laser Nd: YAG) e un laser rosso (643 nm, laser a diodo) per l'eccitazione del donatore e le molecole di colorante accettore nonché un laser blu (491 nm , laser a stato solido pompato a diodi) per candeggio le impurità fluorescenti fondo sulla camera del campione prima della misurazione smFRET. I tre fasci laser sono spazialmente combinato e possono essere selezionati mediante un filtro sintonizzabile acusto-ottico (AOTF). La luce di fluorescenza viene raccolta da un obiettivo di apertura elevato, suddiviso in un donatore e un accettao canale usando uno specchio dicroico e proiettato su due telecamere EM-CCD. La camera del campione è attaccato ad un micrometrico permettendo il movimento in X e Y direzione con due motori passo-passo. Un terzo motore piezo viene utilizzato insieme ad un IR-laser e un rivelatore sensibile grado di costruire un sistema di messa a fuoco automatica per garantire la messa a fuoco ottimale per tutto l'esperimento. Utilizzare alternata eccitazione laser (ALEX) quando si osservano le dinamiche delle traiettorie al contempo daranno 25. Tali dinamiche possono essere causato da una variazioni conformazionali all'interno delle molecole o dalle fluttuazioni di luminosità accettore e accettore lampeggiante. NOTA: ALEX consente la discriminazione tra queste due possibili cause e impedisce errata interpretazione delle traiettorie FRET dinamici. Tuttavia, per ragioni di semplicità, la parte protocollo è limitato all'analisi del film tratto senza ALEX. Attenzione: i laser di Classe 3B sono utilizzati nella configurazione di fluorescenza singola molecola. Assicurarsi che adeguata laprecauzioni di sicurezza ser, secondo le norme del governo locale, sono state prese prima che il sistema è gestito. Eseguire la misurazione dell'assorbimento utilizzato per determinare la resa quantica su un UV VIS-spettrometro (vedi Materiali e Metodi). Eseguire la misurazione dello spettro di emissione di fluorescenza del donatore, lo spettro di assorbimento accettore e l'anisotropia di fluorescenza su uno spettrometro a fluorescenza (vedi Materiali e Metodi). Preparare camere di campione secondo procedure pubblicate 33. In alternativa, il procedimento descritto in [34] può essere utilizzato. Etichettare i campioni realizzati con una coppia molecola di colorante donatore-accettore adatto per smFRET e garantire che vi sia un residuo biotina per l'immobilizzazione sulla superficie della camera del campione. NOTA: Per localizzare una posizione colorante antenna ignoto con il software Fast-NPS sono necessari diversi costrutti campione. Ogni costrutto needs di avere una etichetta nella posizione tintura antenna sconosciuto e un'etichetta alla satellite noto dalla struttura cristallina. Almeno tre diversi costrutti con coloranti attaccati alla posizione dell'antenna e tre diverse posizioni satellitari sono necessari per ottenere risultati accurati. Misure fra le antenne e tra satelliti sono anche utili per migliorare la precisione, tuttavia, questo richiede scambio di molecole di colorante che deve essere inserito correttamente nell'analisi. 2. Montaggio delle Camere di flusso in un supporto personalizzato Tirare tubo in silicone (ID 0,8 millimetri, 2,4 millimetri OD) in viti scheda cavi (M4) e tagliare il tubo su entrambi i lati dritti lasciando una sporgenza di 1 cm su entrambi i lati, utilizzando una lama di rasoio affilato. Regolare la sporgenza del tubo a circa 2 mm su un lato della vite tab. Montare la camera di flusso nel supporto del campione in modo che i fori del vetrino di quarzo corrispondono alle filettature del portacampioni. serraredi entrata e di uscita viti delicatamente per garantire che l'ingresso e l'uscita della camera del campione sono ancora penetrabili. Stringere le quattro viti del supporto di vetro acrilico per fissare la posizione della camera di flusso. tubi Cut silicone (0,58 mm ID, 0,96 millimetri OD) in 20 cm di lunghezza pezzi. Inserire uno dei pezzi verso l'ingresso e la vite di uscita della camera di misura. Chiudere il tubo di ingresso e di uscita utilizzando un morsetto. NOTA: Le camere di esempio assemblati possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. 3. smFRET misura sul TIRF microscopio Utilizzare una siringa per lavare la camera del campione con 500 ml di PBS. Evitare bolle d'aria di entrare nella camera campione in ogni momento creando un droplet alla fine del tubo di ingresso prima di passare a una soluzione tampone diverso. Lavare la camera del campione con 100 microlitri neutravidina soluzione (0,5 mg / ml in PBS) e incubare 15 min a temperatura ambiente. lavaggiola soluzione neutravidina con 500 microlitri di PBS. Avvitare il supporto metallico per il prisma sulla camera campione. Montare la camera del campione alla fase micrometrica del TIRF-microscopio. Assicurarsi di montare la camera campione orizzontalmente diritta possibile davanti l'obiettivo di evitare la defocalizzazione durante il processo di scansione. Avviare il software di controllo delle telecamere EM-CCD e il software per il controllo delle piezo-motori del palco. Regolare il fuoco dell'obiettivo del microscopio guardando i riflessi del laser a infrarossi. Posizionare il prisma (PS991, n = 1,52) sulla parte superiore del supporto metallico del prisma. Regolare la posizione laterale del prisma per assicurarsi che i raggi laser colpiscono il prisma quindi utilizzare un adesivo e incubare con luce UV per 5 min. NOTA: prisma montato può essere riutilizzato con la pulizia. Nel software di controllo della telecamera click "Acquisition Setup" e definire i seguenti parametri di acquisizione: 100 ms INTEGRATtempo di ioni, 401 fotogrammi / film (fotocamera verde), 400 fotogrammi / film (red camera), moltiplicatore di elettroni guadagno 225, pre-amplificatore 5x guadagno e indicazione della velocità di 3 MHz a 14 bit. Creare una cartella sul disco rigido locale per la misurazione. Scegliere un nome desiderato per i file di misura, ad esempio, anno-mese-giorno. Nel software impostazioni vanno al pilota "Auto-Save", attivare "Auto Save" e scegliere il formato di file * .sif per l'acquisizione di film. Selezionare la cartella sul disco rigido. Utilizzare il nome della cartella come filestem. Attivare il (valore iniziale impostato a 1) la funzione "AutoIncrement". Attivare l'attaccamento di un operatore al nome del file. Utilizzare "DON" e "ACC" per il donatore e il canale accettore, rispettivamente. Scegliere "_" come separatore. Nel software di controllo della telecamera fare clic su "video" per avviare l'immagine dal vivo della telecamera e lo sfondo candeggina fluorescenza mediante la scansione di camera del campione con intensità massima del laser di tutti e tre i laser (COMcombinato ≈3,000 W / cm 2 per 10 s per ogni campo di vista). Spegnere il laser blu. Diminuire l'intensità del laser verde a circa 200 W / cm 2 e circa 40 mW / cm 2 per il laser rosso se viene utilizzato alternata eccitazione laser (ALEX). Diluire il campione fluorescente biotinilato ad una concentrazione di 50-100 pM. Carico 100 microlitri della soluzione. Il campione viene immobilizzato sulla superficie della camera dopo il legame. NOTA: Assicurarsi di non sovraccaricare la camera. molecole adiacenti devono essere separati l'uno dall'altro. Se necessario, caricare ulteriori 100 ml di un campione più concentrato 2x alla camera. Sigillare l'ingresso e l'uscita tubi della camera di misura con fascette dopo il caricamento è completato. Spegnere tutti i laser e utilizzare i piezo-motori per muovere la camera di flusso due campi di vista più. Nel software di controllo della telecamera cliccare su "segnale di prendere" per avviare la registrazione di filmati e l'interruttoreil laser allo stesso tempo. Assicurarsi che più dell'80% delle molecole sono sbiancati dal fine del film regolando la potenza del laser. Ripetere i punti 3.17 e 3.18 per l'intera regione della camera del campione preimbianchiti. 4. Acquisizione della mappa di trasformazione ( "beadmap") Preparare una camera di flusso, come descritto nelle sezioni 1.1, 1.2 e 2. Utilizzare perline multispettrali fluorescenti avidina rivestite che mostrano emissione di fluorescenza del donatore e il canale accettore. Vortex lo stock per 1 minuto, quindi diluire 50 ml di magazzino in 50 microlitri di DDH 2 O. Vortex ancora per 1 minuto, ultrasuoni 1-2 minuti, poi vortice altri 10 s. Eseguire operazioni descritte per le misure smFRET (sezione 3,5-3,10). Carico 100 ml (1 volume della camera) delle 1: 2 perline fluorescenti diluito nella camera di flusso. Attendere 10 min per le perline fluorescenti di legarsi alla superficie. Utilizzare i parametri di acquisizione in 3.9, ma Change di lunghezza di film a 26 (camera verde) e 25 (camera rossa) e il guadagno moltiplicatore di elettroni a 10. Impostare l'intensità del laser verde ad un valore di 20 W / cm 2. Prendere un film in un campo di vista con circa 50-100 perline. 5. trattamento e all'analisi dei dati smFRET Utilizzare il costume scritto FRET software SM per l'analisi del beadmap (vedi Materiali e Metodi) ei film acquistati. Avviare il programma viewPlot1.m. Clicca su Analisi | Batch Analysis, deselezionare l'opzione "ALEX" se non è stato utilizzato. Per ottenere le migliori prestazioni scegliere la soglia per il picco scoperta "alta". Premere il tasto "OK". Scegliere "NO" alla domanda se un beadmap è già stato analizzato. Sfoglia la cartella contenente il beadmap acquisito e selezionare il file .sif * (con un doppio clic su di esso). Nella finestra successiva stampa di dialogo "OK". NOTA: Se un beadmap ha già analizzato in una precedente misurazione, scegliere "SÌ" qui e selezionare il beadmap salvato navigando alla cartella corretta e fare doppio clic sul beadmap * file .map. Continuare con il passaggio 5.8. Scegliere due talloni singoli posizionate negli angoli opposti del campo di vista. Le intensità dei pixel sono a colori dal blu scuro (bassa intensità) al rosso scuro (alta intensità). Clicca sul centro del primo tallone. Se il centro della molecola può essere situato in modo chiaro dalla codifica a colori, scegliere "SI" oppure cliccare su "NO" e scegliere un paio molecola diversa. Posizionare il mirino sul pixel che mostra la massima intensità e premere "TENERE". Ripetere il processo con il secondo canale. Clicca sulla molecola in un angolo opposto e ripetere i punti 5.5 e 5.6. NOTA: il relativo spostamento dei pixel dei due canali viene visualizzato nella finestra di comando e della mappa di trasformazione viene automaticamente salvato come file * .map nella cartella contenente il beadmap * .sif file <./ Li> Per caricare i donatore e accettore film (* .sif) per il "analisi batch", accedere alla cartella, selezionare tutti i film che saranno analizzati e cliccare su "OK". Nella finestra di dialogo successiva, premere "OK". NOTA: L'analisi dei lotti è terminata quando l'ultimo corsia visualizzato nella finestra di comando inizia con "analizzare finito …". Le molecole rilevate vengono visualizzati in una nuova finestra, che indica anche lo spostamento relativo del donatore e il canale accettore determinata dalla mappa di trasformazione. Per caricare i file video in batch cliccare su File | Load. Deselezionare l'opzione "ALEX" se non è stato utilizzato. Impostare la smoothwidth a 10 e fare clic su "OK". Scegliere la cartella contenente i file * .ttr e cliccare su "Seleziona tutto" e "OK" nel prossimo menu contestuale. Se la traccia visualizzata presenta le fasi caratteristiche smFRET (Figura 2) Premere il pulsante Toggle "Non selezionato" e primaselezionare il punto ora di inizio della manifestazione FRET spostando la linea con il cursore del mouse e cliccando con il tasto sinistro del mouse. Quindi selezionare il punto temporale del candeggio della molecola accettore ed infine il punto di tempo del candeggio della molecola donatrice. Nella finestra successiva l'efficienza FRET è tracciata in blu. Per selezionare la stampa traccia sul pulsante "Sì", altrimenti scegliere "No". Per ri-accedere a una traccia temporale fare clic sul pulsante "Indietro". Ripetere la procedura fino all'ultima molecola del film. Dopo aver analizzato l'ultima molecola in un film salvare le tracce selezionati facendo clic su "File | Save". Salvare le tracce selezionate nella stessa cartella dei file * .sif. Ripetere i passaggi 5,10-5,13 per tutti i film acquisiti. Eseguire il programma di combine_fret_results.m. Selezionare la cartella contenente i file * .res e tutti i file * .FRETonly_trace. Salvare le tasto e telaio-saggio file FRET molecola-saggio come MW.dat eFRW.dat rispettivamente. NOTA: I file * .dat vengono salvati come file ASCII. Il file FRW.dat contiene sei colonne e una riga per ogni FRET-frame. La sesta colonna contiene l'efficienza FRET frame-saggio corretto. Il file MW.dat contiene 21 colonne e una riga per molecola FRET selezionato. La terza colonna contiene l'efficienza FRET molecola-saggio. 6. Visualizzazione smFRET dati in istogrammi NOTA: Per estrarre l'efficienza smFRET media di tutti i dati smFRET registrati i dati della struttura-saggio oi dati molecola-saggio sono tracciate in istogrammi e analizzati utilizzando gaussiana si adatta a (più) picchi. Nel seguito, il protocollo utilizza un software per l'analisi dei dati commerciali (vedi Lista dei materiali). Tuttavia, qualsiasi altro software disponibile può essere usato al posto. Aprire un software di analisi dei dati (vedi Materiali List). Fare clic su File | Importa | ASCII multipla. Selezionare la cartella contenente il file FRW.dat. Selezionare il file e premere "OK & #34 ;. Accettare l'opzione di ingresso con "OK" senza un cambiamento. Selezionare la terza colonna C (Y) contenente le efficienze FRET corrette, fare clic destro sulla colonna e selezionare Plot | Statistiche | Istogramma. Nella finestra istogramma doppio clic sulle colonne e deselezionare "binning automatica" e selezionare un contenitore di dimensioni desiderata, ad esempio, 0,05. Anche scegliere i valori di inizio e fine, ad esempio, -0,025 e 1,025. Selezionare le colonne del istogramma sinistro del mouse su di essi. Quindi fare clic destro e scegliere "andare a Bin foglio di lavoro". Selezionare la colonna "Conti" di sinistra-clic su di esso e quindi fare clic destro e selezionare Plot | Colonna / Bar / Pie | Colonna. Nella trama barra di colonna di andare a Analisi | montaggio | non lineare curva in forma | finestra di dialogo Apri. Scegliere "gaussiana" sotto Funzione poi andare al pilota "Parametro". Deselezionare parametro di inizializzazione automatica. Fissare il valore di offset (Y0) a 0. Fare clic su "Fit". NOTA: La funzione di misura, nonche la de raccordocode sono ora visualizzati nella trama colonna. Il valore "xc" fornisce il centro della funzione forma, cioè, la media FRET efficienza che serve come parametro di input per il software NPS. 7. Misura della Quantum Yield Eseguire determinazione resa quantica con il relativo metodo simile alla procedura descritta da Würth et al. 35, con rodamina 101 disciolto in etanolo (QY = 91.5%) come standard. spettri di assorbimento Record ad uno spettrometro UV-VIS utilizzando un volume di 80 ml in una cuvetta di assorbimento 1 cm di cammino. L'assorbanza alla lunghezza d'onda che sarà utilizzato per l'eccitazione di fluorescenza deve essere ≤ 0,05. spettri di emissione Record su uno spettrometro lampada calibrata operante a conteggio di fotoni. Effettuare le misurazioni con polarizzatori Glan-Thompson nell'eccitazione (0 °) ed emissione (54.7 °) percorso (condizioni Magic Angle) utilizzando un spectr al di banda di circa 5 nm e 2,5 nm per l'eccitazione e l'emissione monocromatore rispettivamente. Misura campioni dopo il conferimento ad una cuvetta di fluorescenza da 3 mm lunghezza del percorso facendo attenzione che il tasso di conteggio non superi i 10 6 s -1. Calcola resa quantica in base alle dove n ed n Std sono gli indici di rifrazione del solvente del campione e lo standard rispettivamente. f (λ) e f_Std (λ) sono le intensità di fluorescenza del campione e standard in corrispondenza del λ lunghezza d'onda. A (λ ex) e A std (λ ex) sono l'assorbanza del campione e di riferimento alla lunghezza d'onda di eccitazione e Φ std è la resa quantica dello standard. Le "> 8. Calcolo della Isotropica Förster Raggio Calcolare il raggio isotropo Förster ( ) Dallo spettro di emissione della molecola donatrice, lo spettro di assorbimento della molecola accettore, la resa quantica del donatore e l'indice di rifrazione del mezzo. Utilizzare il freeware PhotochemCAD per il calcolo del . Tuttavia qualsiasi altro software disponibile può essere usato al posto 36. 9. Misurazione delle anisotropie Determinare allo steady-state anisotropie fluorescenza da registrazioni di spettri di fluorescenza con varie impostazioni polarizzatore di eccitazione / emissione (V / V, V / H, H / V, H / H) 36. Calcolare il Fattore G, che corregge manufatti polarizzazione dello strumento, per ogni lunghezza d'onda dallarapporto e usarlo per calcolare il valore anisotropia per ogni lunghezza d'onda: dove XY indica l'intensità di eccitazione per la polarizzazione x e polarizzazione delle emissioni y. La media dei valori in tutta la gamma dello spettro di emissione per il calcolo della anisotropia di fluorescenza dello stato stazionario. 10. Installazione di Fast-NPS Software Scarica UCSF Chimera da http://www.cgl.ucsf.edu/chimera e seguire la guida di installazione. Vai al sito dell ' "Istituto di Biofisica"a Ulm Università: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Scaricare la versione corrente di Fast-NPS ed estrarlo in una cartella a scelta. Aprire la sottocartella "Redistributable" e installare il Visual C ++ Redistributable che è appropriato per il sistema. 11. Centrare il file PDB Aprire il file PDB (s) di interesse in Chimera. Selezionare tutti gli atomi del complesso macromolecolare e calcolare le coordinate del baricentro (Strumenti | Struttura Analisi | Assi / Aerei / Centroidi | Definire baricentro … | Ok). Aprire la risposta LOG (Preferiti | Rispondi LOG) e lo strumento di trasformazione (Strumenti | Movimento | trasformare le coordinate). Inserire le coordinate del baricentro riportato nella risposta registro nella casella di testo "Shift" della finestra di trasformare le coordinate e cambiare il segno di ogni coordinata. Premere il tasto "Applica" e salvare il file con "Salva PDB" (File | Save PPB). 12. Impostazionei Priori di posizione NOTA: Tutti i valori sono considerati in Angstrom. Avviare la lingua calcolo tecnico e cambiare la cartella corrente alla cartella Fast-NPS locale. Inserire nella finestra di comando: FastNPS. Creare un nuovo jobfile nel Project Manager (Progetto | Nuovo). Impostare la prima posizione (Tools | tintura del modello precedente). Nel pannello "basi precedenti" definire la risoluzione spaziale della posizione prima inserendo il suo valore (2 è consigliato). Escludere l'interno della macromolecola attivando la casella di controllo e facendo clic sul pulsante "carico PDB". Selezionare e caricare il file PDB centrato come descritto nella Sezione 11. Specificare il diametro approssimativo (si consiglia 13 A, vedi la discussione) del colorante inserendo il suo valore. Inserire una distanza Scheletrizzazione, cioè, la distanza molecola colorante può penetrare nella macromolecola (si consiglia 2 Å). Nelpannello "dimensione massima prima" inserire le coordinate minimi e massimi della posizione precedente (consigliata: x in [-150.150], y in [-150.150] e z in [-150.150]). Quando si definisce un satellite, attivare la casella di controllo "allegato via linker flessibile" nel pannello "basi precedenti" e inserire nel pannello "linker" le coordinate dell'atomo (nel file PDB centrato) in cui la molecola colorante viene attaccato. Inoltre, specificare la lunghezza e il diametro del linker immettendo i loro valori (si consigliano 13 Å e 4.5 Å, vedi la discussione). In caso di un'antenna saltare questo punto. Premere il pulsante "calcolare il volume accessibile". Salvare la posizione di prima ed eventualmente esportare per scopi di visualizzazione utilizzando software come Chimera. 13. Definizione della geometria della rete Aprire la finestra Definisci misura (Modalità | Edit Geometry). Creare una nuova molecola di colorante premendo il calciosu "Nuovo" nel pannello "Coloranti". Impostare la sua anisotropia di fluorescenza (sezione 9) inserendo un valore e selezionare un modello di colorante all'interno del menu a tendina "modello Dye". Premere il pulsante "Carica", selezionare la posizione corrispondente prima e selezionare la casella di controllo di attivazione del colorante. Ripetere questa procedura per tutti i coloranti, cioè, per tutte le antenne, nonché per tutti i satelliti. Dopo aver creato tutti i coloranti, definire le misure. Creare una nuova misurazione facendo clic su "Nuovo" nel pannello "Misure". Selezionare i suoi partner FRET nei menu a discesa "Dye1" e "Dye2" qui sotto. Inserire l'efficienza smFRET con l'errore e il raggio Förster isotropo di questa coppia colorante. Infine, selezionare la casella di controllo di attivazione della misura. Ripetere questa procedura per tutte le misurazioni. NOTA: Spesso la rete diventa sempre più complesso, in modo che l'utente potrebbe confondersi. Al fine di Prevent errori, controllare la rete visivamente premendo il pulsante "Controlla rete". La figura mostra i coloranti attivati ed indica le misurazioni tramite linee di interconnessione i coloranti tasto. 14. Calcolo Aprire la finestra di calcolo (Modalità | Calcolo). Se ogni colorante nella rete ha un modello specifico assegnato, selezionare "Definito dall'utente" e avviare il calcolo premendo il tasto "Calcolo". Per avere tutti i coloranti nello stesso modello, selezionare una delle cinque modelli (classico, iso, meanpos-iso, VAR-meanpos-ISO e VAR-meanpos) e continuare. NOTA: La finestra di comando indicherà l'avanzamento del calcolo. Fast-NPS farà con un messaggio pop-up, quando il calcolo è stato completato. 15. visualizzazione dei risultati Al fine di esportare i volumi credibili dei coloranti, aprire la vista Risultati finestra (Modello | Guarda i risultati). densità di colorante Export: Esportarecoloranti singolarmente o tutti contemporaneamente. Al fine di esportare un singolo colorante selezionarla nel pannello "Coloranti visualizzati" e premere il tasto "Export Densità". Inserisci risoluzione (si consiglia 2) e scegliere un tipo di file per l'esportazione. Sulla destra la densità è previsto e alcune delle sue caratteristiche matematiche sono presenti. Per esportare tutti i coloranti spingono contemporaneamente "Batch Export". Aprire i file di densità con conseguente Chimera. 16. Controllo consistenza del Prescelto Modello Combinazione Aprire la vista Risultati finestra (Modello | Guarda i risultati). Se nel pannello "Calcolo Info" casella di testo "consistenza" mostra un valore inferiore al 90% il modello attuale non rappresenta le efficienze smFRET misurati sufficientemente ed è quindi incoerente. In caso di incoerenza premere il pulsante "Coerenza dettagliata". Ricerca per le misure che hanno un valore inferiore al 90%. Se uno o più colorantis sono prevalentemente coinvolti in queste misurazioni, i loro modelli sono suscettibili di causare l'incoerenza. Prendere in considerazione diversi modelli di tintura per questi coloranti e rieseguire il calcolo Fast-NPS.

Representative Results

La trascrizione è il primo passo per l'espressione genica in tutti gli organismi. In Archaea, trascrizione è effettuata da un singolo RNA polimerasi (RNAP). Rispetto al eucarioti, il archeali RNAP ha una somiglianza strutturale notevole alle loro controparti eucariotiche, pur avendo una macchina di trascrizione semplice. Così, Archaea può essere utilizzato come sistema modello per studiare eucariotica inizio trascrizione RNA polimerasi II (Pol II). Di recente, l'architettura completa del complesso aperto archeali RNA polimerasi è stata determinata dalla singola molecola tasto e NPS. I dati di analisi dei criteri di rete è stato utilizzato per costruire un modello del completo archeali aperta complesso promotore, che fornisce indicazioni utili nel meccanismo di trascrizione iniziazione. Per chiarire questa struttura, l'efficienza smFRET sono stati misurati tra molecole di colorante antenna sconosciuti situati all'interno del com promotore apertoPlex e diversi noti molecole di colorante satellitare che sono stati incorporati in cinque siti di riferimento nel RNAP, le cui posizioni sono noti da strutture cristallografiche (PPB-ID: 2WAQ) 37. I coloranti antenna erano attaccati a una delle diverse posizioni sul DNA non-template, TFB, TBP o TFE. L'intera rete utilizzata in questo studio consisteva di oltre 60 distanze misurate. Figura 7 riporta il modello del completo archeali complesso aperto promotore costruito dall'analisi NPS. Esso comprende il promotore DNA a doppia elica (chiaro e blu scuro), l'RNA polimerasi (grigio) e l'avvio fattori di trascrizione TBP (viola), TFB (verde) e TFE (giallo). Il modello si sovrappone con i risultati dell'analisi NPS, i volumi credibili, che sono stati calcolati utilizzando il modello classico (A), il modello ISO (B), il modello meanpos-ISO (C), il modello VAR-meanpos-iso (D) e il VaR-meanpos il modello (E). Figura 1: Workflow di acquisizione ed elaborazione dei parametri necessari per il calcolo Fast-NPS. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: esemplare intensità di fluorescenza traccia temporale di un evento smFRET. Le intensità di fluorescenza del donatore (verde) e la molecola accettore (rosso) che mostra le tre fasi caratteristiche, vale a dire che: smFRET, II: donatore di fluorescenza dopo photobleaching accettore, III: fluorescenza di fondo dopo photobleaching donatore.g2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: Rappresentazione schematica della camera di flusso per gli esperimenti smFRET. La camera di flusso è montato su un supporto in metallo personalizzata con i supporti di vetro acrilico. Il sandwich design della camera di flusso comprende un vetro di quarzo (silice fusa) scorrere con due fori per il fissaggio ingresso e uscita tubi, una pellicola sigillante e un vetrino che chiude la camera di flusso. Il prisma per l'illuminazione TIRF è montato sulla parte inferiore della camera di flusso. viti scheda Hollow forniscono l'ingresso e uscite per la camera di flusso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /> Figura 4: Preparazione del vetrino di quarzo e la pellicola sigillante. disegno meccanico del vetrino di quarzo che indica le posizioni dei fori (espressa in millimetri). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: disegno meccanico della camera di flusso. Le misure per la porta-prisma di alluminio, acrilico titolari di vetro e alluminio telaio di montaggio sono espresse in millimetri. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. IGURA 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/> Figura 6: Rappresentazione schematica della configurazione TIRF prisma-tipo usato per gli esperimenti smFRET. Abbreviazioni per i componenti ottici: A, apertura; DM, specchio dicroico; F, filtro per le emissioni; L, obiettivo; M, specchio; O, obiettivo; P, prisma; PSD, posizione sensibile fotodiodo; S, campione; PS, fase di posizionamento; T, telescopio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7: I risultati della simulazione delle diverse ipotesi di modello. Tutte le immagini mostrano la archeali RNA polimerasi (PDB-ID: 2WAQ, vista dall'alto) insieme al modello di promotore di DNA (rispettivamente tDNA e ntDNA in blu e ciano,), TBP (viola), TFB (verde) e TFE (giallo)nel archeali aprire complesso 30. I volumi credibili sono sovrapposti per i risultati della simulazione NPS di (A) il modello classico, (B) del modello ISO, (C) il modello meanpos-iso, (D) il modello VAR-meanpos-iso e (E) il var -meanpos modello. Tutti i volumi sono iscritti al 68% di credibilità. La reti VAR-meanpos classico e sono coerenti con i dati smFRET. Al contrario, le reti dove per tutti i coloranti si sceglie la iso, meanpos-iso o il modello VAR-meanpos-iso non sono coerenti con i dati misurati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Vi presentiamo la procedura di installazione e sperimentale per determinare con precisione l'efficienza FRET tra coloranti collegati tramite linker flessibili ai biomacromolecole, vale a dire, acidi nucleici e / o proteine.

Per garantire precise misurazioni smFRET (punto 3), è fondamentale per escludere l'aria dalla camera di flusso in qualsiasi momento durante la misurazione. Inoltre, assicurarsi di non sovraccaricare la camera di flusso con fluorofori. I fluorofori devono essere chiaramente separate per garantire la corretta analisi. Come coppie smFRET, che non presentano sbiancamento del donatore devono essere esclusi dall'analisi, assicurarsi che> 80% delle molecole nel campo visivo sono sbiancato alla fine del film. Per tenere conto di disomogeneità nel campione del β-fattore e il γ-factor, correzione cross-talk e relative efficienze di rilevamento del canale donatore e accettore, rispettivamente, sono calcolati per ogni FRET accoppiare singolarmente.

<p class= "Jove_content"> Le impostazioni della fotocamera (tempo di integrazione, di elettroni guadagno moltiplicatore di guadagno pre-amplificatore e di tasso di lettura descritto nella Sezione 3.9) deve essere impostata su valori che danno il miglior compromesso tra rapporto segnale-rumore, gamma dinamica e il tempo-risoluzione. Hanno bisogno di essere ri-aggiustato per i diversi esperimenti o se l'hardware diverso viene utilizzato. I numeri di frame devono essere sufficientemente elevato per assicurare che la maggior parte del donatore molecole candeggiante entro il tempo di osservazione.

Per le misure sul spettrometro di fluorescenza (sezioni 7 a 9) un buon compromesso tra l'intensità del segnale e la risoluzione spettrale dei dati registrati deve essere trovato. A tal fine le fessure eccitazione ed emissione percorso dello spettrometro a fluorescenza devono essere adattati in funzione dello strumento utilizzato e la concentrazione del campione.

Inoltre, vi presentiamo il metodo di analisi Fast-NPS per ottenere informazioni strutturali di MACROM transitoria o dinamicacomplessi olecular. NPS è stata applicata per rivelare il percorso del non-modello filamento di DNA e la posizione dei fattori di trascrizione iniziazione nel archeali complesso aperto RNA polimerasi. Utilizzando la rete di più di 60 diverse misure di distanza, abbiamo dimostrato che Fast-NPS, equipaggiata con un motore di campionamento di recente implementato (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. in preparazione), riduce il tempo necessario per l'analisi di questa rete smFRET complessa ≈2 ordini di grandezza, rispetto al metodo di NPS globale originale ^27. la robustezza dell'algoritmo è radicata in un campionatore Metropolis-entro-Gibbs in combinazione con un sistema di rinvenimento parallelo. Fast-NPS mostra riproducibilità esatta dei risultati della rete ed è coerente con i risultati pubblicati in precedenza ^30.

Diversi metodi sono stati pubblicati con l'obiettivo di dedurre informazioni strutturali da misure smFRET ¹¹ </s^up>, ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. Tutti questi approcci forniscono solo un modello specifico colorante. Così, coloranti, che non soddisfano le ipotesi formulate dal rispettivo modello, non possono essere utilizzati o portare a false informazioni strutturali. Fast-NPS, al contrario, permette di selezionare per ogni molecola di colorante un modello diverso. Questo aiuta a spiegare diverso comportamento conformazionale di entrambi, la molecola di colorante stesso, nonché il linker usato per il suo fissaggio. Le frazioni molecolari locali della molecola di colorante, come pure le sue proprietà fisiche determinerà quale modello è più appropriato.

Per la rete smFRET analizzato del complesso di inizio archeali, un assunto isotropo per tutti molecole di colorante porta ad una diminuzione drastica in la dimensione dei volumi credibili rispetto al modello classico. In combinazione con una posizione dinamica media per tutti colorante molecole la mediana di tutti dimensioni volumetriche credibili (al 95%) si riduce a meno di 0,5 nm ^3. Tuttavia, questi posteriori molecola di colorante non è più coerente con le loro misurazioni sono smFRET, indicando che le ipotesi fatte portare a false informazioni strutturali. Al contrario, i posteriori determinati nel modello classico sono coerenti con le efficienze smFRET determinati.

Come l'assunzione di posizione isotropo e / o dinamico media per tutti i coloranti portare a incongruenze, Fast-NPS consente priori molecola di colorante in cui ogni colorante può essere assegnato uno dei cinque modelli. Ogni modello utilizza lo stesso volume accessibile. L'algoritmo per il calcolo dei AVs colorante fa numerose assunzioni. Dapprima, la forma spaziale della fluoroforo è approssimata da una sfera. Così, un diametro tenendo conto WID del fluoroforoesimo, l'altezza e lo spessore dovrebbe essere usato (sezione 12). Inoltre, la forma del linker è approssimata da un'asta flessibile. I valori presentati nella sezione 12 sono stati calcolati per il colorante Alexa 647 collegato tramite un linker 12-C. Ad oggi, non è possibile determinare con precisione a priori quale modello è più adatto, in una geometria sperimentale, e quindi tutti i modelli deve essere testato. In generale, si sceglierà il modello che dà la più piccola dimensione posteriore possibile, pur essendo coerente con i dati. Per verificare se una scelta di modelli è coerente con i dati smFRET, calcoliamo sia il posteriore e la probabilità. Consistenza significa che oltre il 90% dei campioni raccolti posteriore sono all'interno dell'intervallo di confidenza 95% del rischio.

Se è vero che il basso l'anisotropia, minore è l'incertezza di distanza, in una rete smFRET disposizioni geometriche delle molecole di colorante devono anche essere presi in considerazione. Così, mentre representing molecole di colorante con una bassa anisotropia di fluorescenza con un modello ISO è una tipica prima scelta, il test di coerenza fornisce un mezzo più diretto per la selezione del modello di tintura corretta. La scelta ottimale di modelli colorante può portare ad un drastico aumento precisione localizzazione e allo stesso tempo mantenere la consistenza della rete con i dati di FRET.

Per riassumere, Fast-NPS consente di ottenere informazioni strutturali e dinamiche di grandi complessi macromolecolari. In contrasto con i metodi strutturali comuni come la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica crio questo permette di monitorare complessi altamente flessibili o transitori, così ampliando notevolmente la nostra comprensione meccanicistica dei processi biologici complessi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

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Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

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