Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Структурная информация от одной молекулы FRET Эксперименты с помощью быстрого нано-системы позиционирования

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

Определение структуры биомолекул является ключевым условием для понимания его функции. Два хорошо зарекомендовавшие себя методы определения структуры являются крио-электронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии ^{^1,} ^2. Сегодня оба метода обеспечивают высокое разрешение структурную информацию с разрешением вплоть до уровня ангстрем. Эти два метода широко использовались для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно были улучшены на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур до сих пор представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, в частности , когда большие динамические и переходные комплексы исследованы ^3.

Для изучения динамики макромолекулярных комплексов и структурно-функциональные отношения, в частности, методологии одной молекулы имеют провided полезная информация ^4. Несколько новых стратегий были разработаны обеспечение ортогональный подход к приобретению структурной и динамической информации. Примерами являются высокая скорость AFM ^5, механические манипуляции ^6, флуоресцентная микроскопия локализации ^7, а также одной молекулы Ферстер – резонансная передача энергии (smFRET) ^{^8,} ^9. Так как довольно рано FRET был назван молекулярный линейкой, из – за расстояния зависимости от длины шкалы биомакромолекулах ^10.

Одним из наиболее интересное применение smFRET заключается в использовании информацию о расстоянии , полученные из измерений smFRET для вывода структурной информации ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ¹⁵ </sup^>, ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. Из-за высокого временного разрешения smFRET, положение подвижных частей структуры белка может быть локализована. Тем не менее, для того , чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET важных параметров коррекции относительно молекул красителя должны быть определены во время измерения ^24. С помощью этих коэффициентов коррекции, эффективность FRET E _FRET может быть вычислена по формуле

,

где I _A и I _D </sUB> являются интенсивности флуоресценции донора и молекулы акцептора соответственно (см рисунок 2). Β-фактор учитывает перекрестных помех, утечку излучения донора в акцептора канала и рассчитывается

где я _'A и I' _D являются интенсивности флуоресценции донора и молекулы акцептора после фотообесцвечивание акцепторной молекулы.

Γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также различия в квантовый выход флуоресценции донора и акцептора красителя. Он рассчитывается из каждого отдельного времени следа от

Обратите внимание, что это описание пренебрегает прямое возбуждение молекулы акцептора, которая иногда становится важным и должны были бы быть скорректирован, а также. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно для возбуждения как донора, так и акцептора в схеме переменного ²⁵ для того , чтобы различать между фото-физических изменений и структурной динамики.

Для того , чтобы не только получить количественную эффективность smFRET , но и количественную информацию о структуре, система Nano-позиционирования (NPS) была введена в 2008 году ^26. Название было выбрано на основе его сходства с спутниковой системы глобального позиционирования (GPS). NPS представляет собой гибридный метод комбинирования smFRET и данных рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных позиций красителя в biomacromolecular комплексов. сrystal структура служит в качестве опорного кадра , и результаты smFRET используются для получения расстояния между информацией неизвестной позиции флуорофора (антенны) , и положением , известной из кристаллической структуры (спутника). В последовательных экспериментах расстояния между антенной и несколькими спутниками измеряются и положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы для анализа на основе оценки байесовской параметра. В результате не только правдоподобным положение антенны вычисляется, но ее полное распределение 3D неопределенность, так называемая задняя, визуализировали с помощью надежных объемов. Кроме того, NPS была расширена , чтобы обеспечить анализ полных smFRET сетей ^27.

NPS был использован для решения ряда важных вопросов в эукариотической транскрипции, а именно по ходу вверх по течению ДНК, ДНК нешаблонном и зарождающейся мРНК в элонгации со РНК-полимеразы IImplex ^{^12,} ^28, также демонстрирует эффект инициации транскрипции факторов ²⁶ и динамическая архитектура открытопорожденного промотором комплекс ^29. Кроме того, NPS был использован для выяснения структуры архей РНК – полимераза открытого комплекса ³⁰ и , в частности , положения инициации транскрипции фактора ТФЭ, который связывается на конкурсной основе того же сайта , как фактор транскрипции удлинение Spt4 / 5 ^31.

С тех пор, ряд на основе smFRET структурных подходов были опубликованы ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23. При сравнении различных структурных методов, основанных smFRET, становится ясно, что видимая точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя. Следует отметить, чтомолекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью, Фаст-NPS был введен ^32. Быстро NPS использует усовершенствованный алгоритм дискретизации уменьшая время вычислений резко. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнить структурный анализ и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей краситель, который будет описан далее. Самая консервативная модель, названная классическим, предполагает , что краситель занимает только один, но неизвестное, положение. В этом положении, флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется из его соответствующего (зависящих от времени) анизотропии флуоресценции. Ориентация конуса не известно, что приводит к большой неопределенности при преобразовании измеренных эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель является консервативным, так как это приведет к наименьшему точности по сравнению с режимом другой красительлевая сторона Только для очень коротких расстояниях следует предположения, сделанные по классической модели приводят к заметно неправильного определения положения. Для типичных значений smFRET, правильное положение всегда заключается в сравнительно большой объем заслуживающей доверия.

Однако, так как более высокая точность желательно, важно разработать и протестировать альтернативные модели красителей, которые могли бы помочь улучшить точность. Если краситель вращается намного быстрее , чем его присущего времени жизни флуоресценции, так называемая модель ISO может быть применен. Здесь коэффициент ориентации х ² (необходим для расчета отличающимися пулевыми радиус Forster ) Устанавливается на 2/3. В результате вычисляемое достоверные объемы почти на два порядка величины меньше , по сравнению с теми , в классической модели ^32. В случае, когда флуорофор найдена в среде, которая позволяет не только быстро reoriентация, но дополнительно быстрое движение во всем его объеме доступной, модель meanpos-ISO должен быть использован. В этой модели, краситель эффективно занимает только одну среднюю позицию, где пространственное усреднение объясняется полиномиального преобразования расстояния ^15. Данная модель применяется , если, например, (обычно гидрофобный) краситель присоединен к гидрофильной области, например, ДНК. Применение модели meanpos-изо приводит к дальнейшему уменьшению размеров достоверных объемов с помощью примерно в два раза. Тем не менее, краситель связан с белком, возможно связывать обратимо с несколькими гидрофобными участками в его стерически доступном объеме (AV). Флуорофор , что мгновенно переключается между этими областями, но в пределах одной области проходит свободное вращение и быстро локализованы движение лучше всего описывается моделью VAR-meanpos-ISO. Для подобной ситуации , в которой краситель не может свободно вращать VAR-meanpos применяет модель. Более d etails об этих моделей можно найти в нашей недавней публикации ^32.

Эти модели обеспечивают обширный репертуар специально для учета различных средах краситель может столкнуться и применять их разумно оптимизирует его локализации точности. В Fast-NPS каждая молекула красителя прикреплены к определенному положению может быть назначен отдельному лицу модели, таким образом, что FRET-партнеры могут иметь различные модели. Это позволяет неограниченную и близкое к природе моделирование. Тем не менее, важно, что один выполняет строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации модель по-прежнему в соответствии с экспериментальными данными. Эти тесты включены в Fast-NPS программного обеспечения.

Для того чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, краска пара конкретных изотропный Фёрстера радиусы (/54782/54782eq5.jpg "/>) Должны быть определены. Таким образом, квантовый выход (QY) донора красителя, эмиссионные спектры флуоресценции донора и спектры поглощения акцептор должны быть измерены. Эти измерения могут быть выполнены в основная часть , с использованием стандартного спектрометра и стандартный флуоресцентный спектрометр. Для каждой пары, то R ₀ затем вычисляется с использованием бесплатный PhotochemCAD и может быть использовано при анализе NPS. Кроме того, ( с разрешением по времени) флуоресценции анизотропией молекул красителя нужно быть получены с использованием поляризации (и времени) чувствительный флуоресцентный спектрометр. Тем не менее, наиболее важные входные параметры для Fast-NPS являются эффективность smFRET, измеренные на одной молекулы установки флуоресцентной микроскопии, такие как полное внутреннее отражение флуоресцентного микроскопа (TIRFM) ,

Здесь мы приводим протокол шаг за шагом для получения данных и применения smFRET Fast-NPS (Рисунок 1).

Protocol

1. Предпосылки и лабораторное оборудование Примечание: Сборка измерительной камеры изображена на рисунке 3. Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: кварцевого стекла (кварцевое стекло) горкой, Уплотнительная пленка и покровное, что герметизирует камеру потока. Измерительная камера устанавливается на настраиваемой держатель образца. Размеры камеры образца и металлического держателя приспособлены, чтобы соответствовать стандартному микроскопию из кварцевого стекла стекло (76 мм х 26 мм). Вырезать из кварцевого стекла слайдов с использованием алмазного бурения (0,75 мм) в позициях , указанных на рисунке 4. Конструкция кварцевых стеклах асимметрична для того, чтобы различать между двумя сторонами каждого слайда. Примечание: кварцевые Слайды могут быть повторно использованы после измерения, пока поверхность не станет поцарапан. Для монтажа камеры, использовать индивидуальные держатели образцов металла , как показано на рисунке 5 </ Сильный>. Держатели образца содержат два потока (M4) для того, чтобы соединить вход и выход для трубки проточной камеры. Кроме того, используются потоки (М3) для установки камеры пробы на металлическом держателе, а также нитей (М3), чтобы закрепить держатель призмы на к нижней части металлического держателя. Выполните измерения smFRET от типа призмы полного внутреннего отражения флуоресцентного микроскопа (TIRFM) (рисунок 6). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM имеет три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донора и акцепторных молекул красителя, а также голубой лазер (491 нм , с диодной накачкой твердотельный лазер) для отбеливания фона флуоресцентных примесей на камере для образца до измерения smFRET. Три лазерных луча пространственно Комбинированное и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Свет флуоресценции собирают высокой апертуры объектива, расщепляется на донора и принятьили канал, используя дихроичное зеркало и проецируются на двух EM-CCD камер. Отборная камера присоединена к микрометр, разрешающий перемещение в x- и у-направлении с двумя шаговыми двигателями. Третий двигатель пьезо используется вместе с ИК-лазера и позиционно-чувствительный детектор, чтобы создать систему автоматической фокусировки, чтобы обеспечить оптимальную фокусировку в течение всего эксперимента. С помощью переменного лазерного возбуждения (ALEX) , когда динамика временных FRET траекторий наблюдаются 25. Такая динамика может быть вызвано либо конформационных изменений внутри молекул или колебаниями яркости акцептора и акцептора миганием. Примечание: ALEX позволяет различать между этими двумя возможными причинами и препятствует неправильной интерпретации динамических траекторий ладу. Тем не менее, для простоты, часть протокола ограничивается анализом фильмов, взятых без АЛЕКСОМ. Внимание: Класс 3B лазеры используются в установке флуоресценции одной молекулы. Убедитесь, что адекватную LAправила техники безопасности Ser, в соответствии с местным законодательством, были приняты до того, как система работает. Выполните измерение поглощения, используемый для определения квантового выхода на UV-VIS спектрометр (см Материалы и методы). Выполните измерение спектра излучения флуоресценции донора, спектр поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентным спектрометром (см Материалы и методы). Подготовка образцов камер согласно опубликованным методикам 33. В качестве альтернативы, эта процедура описана в [34] , может быть использован. Добавьте исследуемые образцы с донорно-акцепторной молекулы красителя пары подходит для smFRET и убедитесь, что существует биотина фрагмент для иммобилизации на поверхности образца камеры. Примечание: Для того, чтобы локализовать неизвестное положение антенны на красителе с Fast-NPS программного обеспечения необходимы различные конструкции образца. Каждая конструкция пeeds иметь одну метку на позиции неизвестной антенны красителя и один ярлык на спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры. По крайней мере, три различные конструкции с красителями, прикрепленных к позиции антенны и три различных положения спутников необходимы для получения точных результатов. Измерения между антеннами, а также между спутниками также могут быть использованы для повышения точности, однако это требует обмена молекул красителя, который должен быть введен правильно в анализе. 2. Монтаж потока камер в держатель на заказ Вытяните силиконовые трубки (0,8 мм внутренний диаметр, 2,4 мм OD) в полые закладках винтами (M4) и разрезать трубу на обоих концах прямой оставляя заходом 1 см с обеих сторон с помощью острым лезвием бритвы. Отрегулировать нависание трубки до приблизительно 2 мм на одной стороне вкладки винта. Установите камеру потока в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в кварцевой стекло соответствует резьбы в держателе образца. затянутьвпускные и выпускные винты осторожно, чтобы гарантировать, что на входе и выходе из камеры для образца все еще проницаемы. Аккуратно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение камеры потока. Вырезать силиконовые трубки (0,58 мм ID, 0,96 мм OD) в длину 20 см, шт. Вставьте одну из частей, к впускным и выпускным отверстиями винта измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубки с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные камеры образцы можно хранить при комнатной температуре в течение до двух недель. 3. smFRET Измерение на TIRF микроскоп Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца с 500 мкл PBS. Предотвращает образование воздушных пузырей из поступающего в камеру пробы в любое время путем создания капельку на конце впускного трубопровода перед изменением другого буферного раствора. Промывка пробоотборной камеры со 100 мкл neutravidin (/ 0,5 мг мл в PBS) растворе и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. мытьИЗЛОЖЕНИЕ neutravidin раствора с 500 мкл PBS. Винт металлический держатель для призмы на образец камеры. Установите камеру для образца до стадии микрометров TIRF-микроскопа. Убедитесь в том, чтобы установить камеру для образца в горизонтальном направлении как можно более прямо перед целью, чтобы избежать расфокусировки во время процесса сканирования. Запустите программное обеспечение контроля за EM-CCD камеры и программное обеспечение для управления пьезо-моторами стадии. Отрегулируйте фокус объектива микроскопа, глядя на отражения ИК-лазера. Поместите призму (PS991, п = 1.52) на верхней части держателя металлической призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы убедиться, что лазерные лучи попали призмы затем использовать клей и инкубировать с УФ-светом в течение 5 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Установленный призмы могут быть повторно использованы путем очистки. В управление камерой программное обеспечение щелчка "Настройка Acquisition" и определите следующие параметры приобретения: 100 мс интегиона Время, 401 кадров / кино (зеленая камера), 400 кадров / кино (красная камера), электронный умножитель получить 225, предварительный усилитель усиления 5x и считывания частоты 3 МГц на 14 бит. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите нужное имя для файлов измерений, например, год-месяц-день. В программе настройки идут к "Автосохранение" наездника, включить "Автоматическое сохранение" и выбрать формат файла * .sif для приобретения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки filestem. Включить "AutoIncrement" функция (набор начальное значение 1). Включить присоединение оператора к имени файла. Используйте "ДОН" и "АСС" донора и акцептора канала соответственно. Выберите "_" в качестве разделителя. В контрольной камеры программного обеспечения нажмите на кнопку "Видео", чтобы начать живое изображение камеры и отбеливатель фоновой флуоресценции при сканировании образца камеры с использованием максимальной интенсивности лазерного излучения всех трех лазеров (COMбинированном ≈3,000 Вт / см 2 в течение 10 лет в поле зрения). Выключите синий лазер. Уменьшение интенсивности зеленого лазера приблизительно 200 Вт / см 2 и около 40 мВт / см 2 для красного лазера , если переменное лазерное возбуждение (ALEX) используется. Развести биотинилированного флуоресцентного образца до концентрации 50-100 пМ. Нагрузка 100 мкл раствора. Образец, иммобилизованного на поверхности камеры при связывании. Примечание: Убедитесь, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга. При необходимости загружать дополнительные 100 мкл 2x более концентрированного образца в камеру. Уплотнение впускной и выпускной трубы из измерительной камеры с помощью зажимов после загрузки завершена. Выключите все лазеры и использовать пьезоэлектрические двигатели для перемещения проточной камеры два поля зрения дальше. В программном обеспечении управления камерой нажмите на кнопку "Take сигнал", чтобы начать запись видеоролика и переключательна лазер в то же самое время. Убедитесь, что более чем 80% молекул отбеливают к концу фильма, регулируя мощность лазера. Повторите шаги 3,17 и 3,18 для всей prebleached образца камеры региона. 4. Приобретение Transformation карты ( "beadmap") Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2. Используйте покрытые авидином флуоресцентные многоспектральные шарики, которые показывают флуоресцентное излучение в донора и акцептора канала. Vortex запас в течение 1 мин, затем развести 50 мкл запаса в 50 мкл DDH 2 O. Vortex снова в течение 1 мин, 1-2 мин разрушать ультразвуком, а затем вихрь еще 10 сек. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (раздел 3.5-3.10). Нагрузка 100 мкл (1 объем камеры) от 1: 2 разбавленных флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 мин для флуоресцентные шарики, чтобы связываться с поверхностью. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но чанGE длина видеоролика до 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера) и усиление электронный умножитель 10. Установите интенсивность зеленого лазера до величины 20 Вт / см 2. Возьмите один фильм в поле зрения приблизительно 50-100 шариков. 5. Обработка и анализ данных smFRET Используйте пользовательское программное обеспечение написано SM FRET для анализа beadmap (см Материалы и методы) и приобретенные фильмы. Запустите программу viewPlot1.m. Нажмите на анализ | пакетный анализ, снимите флажок "АЛЕКС", если он не был использован. Для лучшей производительности выбрать пороговое значение для пика нахождения "высокой". Нажмите кнопку "OK". Выберите "NO", когда его спросили, если beadmap уже разбирали. Просмотрите папку, содержащую полученную beadmap и выберите * .sif файл (двойным щелчком по нему). В следующем диалоговом окне нажмите кнопку "OK". ПРИМЕЧАНИЕ: Если beadmap уже анализировались в предыдущей мерыния, выберите "YES" здесь и выбрать сохраненный beadmap, перейдя по ссылке в нужную папку и дважды щелкнув на beadmap * .map файл. Продолжить с шагом 5.8. Выберите две отдельные шарики, расположенные в противоположных углах поля зрения. Интенсивности пикселов имеют цветовую маркировку от темно-синего (низкой интенсивности) до темно-красного (высокой интенсивности). Нажмите на центр первого шарика. Если центр молекулы могут быть расположены четко по колоризации, выберите "YES", либо нажмите кнопку "НЕТ" и выбрать другую молекулу пару. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность и нажмите кнопку "Keep". Повторите процесс со вторым каналом. Нажмите на молекулы в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. Примечание: Относительное смещение пикселов двух каналов отображается в окне командной строки и карта преобразования автоматически сохраняется как * .map файл в папку, содержащую beadmap * .sif файл <./ Li> Для загрузки донора и акцептора фильмов (* .sif) для "пакетного анализа", перейдите к папке, выберите все фильмы, которые должны анализироваться и нажмите "OK". В следующем диалоговом окне нажмите кнопку "OK". Примечание: Пакетный анализ завершен, когда последняя полоса отображается в окне командной строки начинается с "законченного анализа …". Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, которое также указывает на относительный сдвиг донора и акцептора канала определяется из карты преобразования. Чтобы загрузить рулонированные файлы фильмов нажмите на File | Load. Снимите флажок "АЛЕКС", если он не был использован. Установите smoothwidth до 10 и нажмите кнопку "OK". Выберите папку, содержащую файлы * .ttr и нажмите "выбрать все" и "OK" в следующем контекстном меню. Если на дисплее след характерные особенности фазы smFRET (рисунок 2) нажмите на кнопку переключения "Не выбран" и первыйвыберите точку времени начала события FRET, перемещая строку с курсором мыши и нажав левую кнопку мыши. Далее выберите точку времени отбелки акцепторной молекулы и, наконец, временной точки отбеливания молекулы-донора. В следующем окне эффективность FRET наносится синим цветом. Для выбора трассировки нажмите кнопку "Да", в противном случае выберите "Нет". Для повторного доступа время трассировки нажмите кнопку "Prev". Повторяйте эту процедуру до последней молекулы фильма. После анализа последнюю молекулу в фильме сохранить выбранные следы, нажав на "Файл | Сохранить". Сохранить выбранные следы в той же папке, что и * .sif файлов. Повторите шаги 5.10-5.13 для всех приобретенных фильмов. Выполнить программу combine_fret_results.m. Выберите папку, содержащую * .RES файлы и все * .FRETonly_trace файлы. Сохранить молекулы-мудрый FRET и покадровой FRET файлы как MW.dat иFRW.dat, соответственно. Примечание: * .dat файлы сохраняются в виде ASCII-файлов. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого FRET-кадра. Шестой столбец содержит исправленный покадровой эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбцов и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET. Третья колонка содержит молекулу-накрест эффективность FRET. 6. Отображение smFRET данных в гистограмм Примечание: Для того чтобы извлечь среднюю smFRET эффективность всех записанных данных smFRET на покадровой данные или данные молекулы-накрест приведены в гистограмм и проанализированы с помощью Gaussian подходит к (несколько) пиков. В дальнейшем протокол использует коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см список материалов). Тем не менее, любое другое доступное программное обеспечение, могут быть использованы вместо. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см список материалов). Нажмите на Файл | Импорт | многократным ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите "OK & #34 ;. Принять возможность ввода с "OK" без изменений. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные эффективность FRET, щелкните правой кнопкой мыши на столбце и выберите Plot | Статистика | Гистограмма. В окне гистограммы дважды щелкните на колоннах и снимите флажок "автоматический биннинга" и выберите нужный размер бункера, например, 0,05. Также надо выбрать начальную и конечную значения, например, -0.025 и 1.025. Выберите столбцы гистограммы левой кнопкой мыши на них. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите "перейти к Bin рабочего листа". Выберите столбец "Counts", щелкнув левой кнопкой мыши на нем, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите Участок | Колонка / Бар / Pie | Колонка. В столбце барной стойкой перейти к анализу | Место | Нелинейная кривая подгонки | Открыть диалога. Выберите "Гауссу" под функцией затем перейдите к всаднику "Параметр". Снимите флажок автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите на кнопку "Установить". Примечание: Подгонка функции, а также фитинга дехвосты теперь отображаются в колонке сюжета. Значение "хс" дает центр подгонки функции, то есть, средняя FRET эффективность , которая служит в качестве входного параметра для программного обеспечения NPS. 7. Измерение квантового выхода Выполнение квантового определения урожая с относительным методом , аналогичным способу , описанному Вюрт и соавт. 35, с использованием родамина 101 раствор ют в этаноле (QY = 91,5%) в качестве стандарта. Запись спектров поглощения в УФ-VIS спектрометра с использованием объемом 80 мкл в абсорбционной кювете 1 см длины пути. Оптическую плотность при длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции должно быть ≤ 0,05. Спектры излучения Запись на спектрометре лампы откалиброван, работающие в режиме счета фотонов. Выполните измерения с Глан-Томпсона поляризаторы в возбуждении (0 °) и эмиссии (54,7 °) пути (магические условия угол) с использованием SPECTR ал с полосой пропускания около 5 нм и 2,5 нм для возбуждения и эмиссии монохроматора, соответственно. Образцы Мера после переноса их на флуоресцентной кювете с 3 мм длины пути ухода принимая , что скорость счета не превышает 10 6 с -1. Рассчитать квантовый выход в соответствии с где п и п Std показатели преломления растворителя образца и стандарта соответственно. F (λ) и f_Std (λ) являются интенсивности флуоресценции образца и стандартом на длине волны. A (λ ех) и СТАНД (λ ех) являются поглощение пробы и ссылки на длине волны возбуждения и Φ СТД является квантовый выход стандарта. ле "> 8. Расчет ИЗОТРОПНОЙ Форстера Радиус Вычислить радиус изотропным Форстер ( ) От спектра излучения молекулы-донора, спектр поглощения молекулы акцептора, квантовый выход донора и показатель преломления среды. Используйте бесплатную PhotochemCAD для расчета , Однако любое другое доступное программное обеспечение может быть использовано вместо 36. 9. Измерение анизотропиями Определение устойчивого состояния флуоресценции анизотропией из записей спектров флуоресценции с различными параметрами поляризатора возбуждения / испускания (V / V, V / H, H / V, H / H) , 36. Вычислить G-фактор, который корректирует поляризационных артефактами прибора, для каждой длины волны отсоотношение и использовать его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны: где я ху указывает интенсивность для поляризации возбуждения х и поляризации эмиссии у. Средние значения по всему диапазону спектра эмиссии для расчета стационарной анизотропии флуоресценции. 10. Установка Fast-NPS программного обеспечения Скачать UCSF Химера из http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке. Перейти на веб-сайте "Институт биофизики"в Ульм университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html~~HEAD=pobj. Загрузите последнюю версию Fast-NPS и распаковать его в папку выбора. Откройте вложенную папку "распространяемый" и установите Визуальная ++ Redistributable C, который подходит для данной системы. 11. Центрирование PDB Файл Откройте PDB файл (ы) интереса к Химеры. Выделить все атомы макромолекулярная комплекса и вычислить координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Топоры / Planes / Центроиды | Определение центроид … | Ok). Открыть Ответить Log (Избранные | Ответить Log) и преобразование Tool (Инструменты | Движение | преобразования координат). Введите координаты центроида, показанного в ответе Войдите в текстовое поле "Shift" в окне преобразования координат и изменить знак каждой координаты. Нажмите кнопку "Применить" и сохраните файл с "Сохранить PDB" (Файл | Сохранить PDB). 12. Настройкадо настоятелей Position Примечание: Все значения считаются в ангстрем. Начало технического языка вычислений и изменить текущую папку на локальном Fast-NPS папку. Введите в окне командной строки: FastNPS. Создайте новый jobfile в менеджере проекта (Project | New). Настройка позиции предварительного (Tools | Model краситель перед). В панели «предыдущие основы» определяют пространственное разрешение до позиции, введя его значение (2 рекомендуется). Исключить внутреннюю часть макромолекулы, активировав флажок и нажав на кнопку "Load" PDB. Выбрать и загрузить файл PDB центрированную, как описано в разделе 11. Укажите примерный диаметр (рекомендуется 13 Å, обсуждение см) красителя, введя его значение. Введите скелетизации расстояние, то есть расстояние молекула красителя может проникать в макромолекулы (2 Å рекомендуется). вПанель "Максимальный размер до" введите минимальные и максимальные координаты положения предварительного (рекомендуется: X в [-150,150], у в [-150,150] и г в [-150150]). При определении спутника, включите флажок "вложении через гибкий линкер" в панели "предыдущие основы" и введите в панели "линкера" координаты атома (в центрированной PDB файл), при которой присоединена молекула красителя. Кроме того, указать длину и диаметр линкера, вводя их значения (13 Å и 4,5 Å рекомендуется, обсуждение см). В случае антенны пропустить этот пункт. Нажмите кнопку "рассчитать доступный объем". Сохранить позицию перед и при необходимости экспортировать его для целей визуализации с помощью программного обеспечения, таких как химеры. 13. Определение геометрии сети Откройте окно Определить измерения (режим | Edit Geometry). Создать новую молекулу красителя, нажав на прикладна "Новый" в панели "Красители". Установите его анизотропии флуоресценции (раздел 9) путем ввода значения и выберите модель красителя внутри выпадающего меню "Dye модели". Нажмите кнопку "Загрузить", выберите соответствующую позицию предварительного и установите флажок Активизировать окно красителя. Повторите эту процедуру для всех красителей, то есть для всех антенн, а также для всех спутников. После создания всех красителей, определяют измерения. Создать новое измерение, нажав кнопку "Создать" в панели "Измерения". Выберите своих партнеров FRET в раскрывающихся меню "Dye1" и "Dye2" ниже. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Forster этой пары красителя. И, наконец, установите флажок Активизировать окно измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. Примечание: Oftentimes сеть становится все более и более сложной, так что пользователь может запутаться. Для того, чтобы Превент ошибки, проверьте сеть визуально, нажав на кнопку "Проверить сеть". На рисунке показаны активированные красители и показывает измерения с помощью линий, соединяющих лада красители. 14. Расчет Откройте окно расчета (режим | Расчет). Если каждый краситель в сети имеет конкретную модель, назначенный, выберите "Заданный пользователем" и начать расчет, нажав кнопку "Расчет". Для того, чтобы иметь все красители в той же модели, выбрать одну из пяти моделей (классический, ISO, meanpos светочувствительность, VAR-meanpos-МОС и VAR-meanpos) и продолжить работу. Примечание: Окно команды покажет ход расчета. Быстро NPS будет делать это с всплывающим сообщением, когда вычисление было завершено. 15. Визуализация результатов Для того, чтобы экспортировать надежные объемы красителей, открыть окно View Results (модель | Просмотр результатов). Плотность экспорта красителей: экспорткрасители по отдельности или все одновременно. Для того чтобы экспортировать один краситель выберите его в панели "Отображаемые Красители" и нажмите "Экспорт Плотность". Введите разрешение (2 рекомендуется) и выбрать тип файла для экспорта. Справа плотность просмотрены и некоторые из его математических характеристик показаны. Для того чтобы экспортировать все красители одновременно нажать "Batch Экспорт". Открыть полученные файлы плотности в Химеры. 16. Согласованность Проверка выбранной модели комбинации Откройте окно View Results (модель | Просмотр результатов). Если в панели "Расчет Info" текстовое поле "Последовательность" отображается значение ниже, чем 90% текущая модель не представляет измеренные эффективности smFRET достаточно и, таким образом, противоречивы. В случае несоответствия нажать кнопку "Подробная согласованность". Поиск измерений, которые имеют значение ниже 90%. Если один или несколько красителейs преимущественно участвуют в этих измерениях, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрим различные модели красителя для этих красителей и повторно запустить Fast-NPS расчет.

Representative Results

Транскрипция является первым шагом в экспрессии генов во всех организмах. В Archaea, транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразы (РНКП). По сравнению с эукариот архейного РНКП имеет поразительное структурное сходство с их эукариотических аналогов, имея более простую транскрипционные механизмы. Таким образом, Археи может быть использован в качестве модельной системы для изучения эукариотической инициации транскрипции РНК-полимеразой II (Pol II). В последнее время полная архитектура архейного РНК-полимеразы открытого комплекса была определена из одной молекулы FRET и NPS. Данные из NPS анализа был использован для построения модели полного архей открытого промоторной комплекса, который обеспечивает полезную информацию о механизме инициации транскрипции. Для выяснения этой структуры, эффективность smFRET были измерены между неизвестными антенных молекул красителя, расположенных в открытом промоторной комсплетение и несколько известных молекул красителя спутника , которые были включены в пять эталонных участков в РНКП, чьи позиции известны из кристаллографических структур (PDB-ID: 2WAQ) 37. Антенна красители были присоединены к одному из различных позиций на нешаблонном ДНК, ТФБ, ТВР или тефлона. Полная сеть, используемая в данном исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний. На рисунке 7 показана модель полного архей открытой промоторной комплекса , построенного из анализа NPS. Она состоит из двухцепочечной ДНК промотор (светло- и темно-синий), РНК-полимераза (серый) и инициации транскрипции факторы ТБФ (фиолетовый), ТФБ (зеленый) и ТФЭ (желтый). Модель накладывается с результатами анализа NPS, заслуживающих доверия объемы, рассчитанные с использованием классической модели (А), модель ISO (B), meanpos-изо модели (C), модель VAR-meanpos-изо (D) и VAR-meanpos модель (Е). Рисунок 1: Технологическая схема сбора и обработки параметров , необходимых для быстрого-NPS расчета. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: Примерное время интенсивность флуоресценции след события smFRET. В интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерных фазы, а именно я: smFRET, II: флуоресценции донора после того, как акцептора фотообесцвечиванию, III: фон флуоресценции после того, как донора фотообесцвечиванию.g2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на настраиваемой металлический держатель с акриловыми держателями стекла. Сэндвич-конструкция камеры потока содержит кварцевого стекла (плавленый кварц) слайд с двумя отверстиями для крепления впускной и выпускной трубки, уплотнительную пленку и покровное, который закрывает камеру потока. Призма для TIRF освещения монтируется на нижнюю половину камеры потока. Полые вкладка винты обеспечивают входное отверстие и выпускные отверстия для проточной камеры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img Alt = "Рисунок 4" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /> Рисунок 4: Подготовка кварцевого стекла стекло и герметизирующей пленки. Механический чертеж кварцевого стекла слайд с указанием позиции отверстий (указаны в миллиметрах). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Меры для держателя призмы алюминия, акрила держателей стекла и алюминиевой монтажной рамы приведены в миллиметрах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. igure 6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/> Рисунок 6: Схематическое изображение установки TIRF призмы типа , используемых для экспериментов smFRET. Сокращения для оптических компонентов: A, диафрагмы; DM, дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, объектив; M, зеркало; O, цель; P, призмы; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; T, телескоп. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 7: Результаты моделирования различных модельных предположений. Все фотографии показывают архей РНК-полимеразы (PDB-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью промотора ДНК (tDNA и ntDNA в синий и голубой, соответственно), ТВР (фиолетовый), ТФБ (зеленый) и ТФЭ (желтый)в архейных открытой комплексной 30. Эти надежные объемы накладываются на результаты NPS моделирования (А) классическая модель, (б) модель ISO, (C) модель meanpos-изо, (D) модели VAR-meanpos-МОС и (Е) вар -meanpos модель. Все объемы приведены на 68% достоверности. Классическая и VAR-meanpos сети согласуются с данными smFRET. В отличие от сетей, где для всех красителей выбран изо, meanpos-изо или модель VAR-meanpos-изо не согласуются с данными измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Мы представляем процедуру установки и экспериментальную , чтобы точно определить эффективность FRET между красителями , прикрепленных с помощью гибких линкеров к биомакромолекулах, т.е. нуклеиновых кислот и / или белков.

Для обеспечения точных измерений smFRET (раздел 3), крайне важно, чтобы исключить попадание воздуха из камеры потока в любое время во время измерения. Кроме того, убедитесь, чтобы не перегружать проточную камеру с флуорофоров. Флуорофоров должны быть четко разделены, чтобы обеспечить правильный анализ. Как smFRET пары, которые не показывают отбеливания донора должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения отбеливают в конце фильма. Для учета неоднородностей в образце β-фактора и γ-фактора, коррекции перекрестных помех и относительной эффективности обнаружения донора и акцептора канала, соответственно, вычисляются для каждой пары FRET по отдельности.

<p class= "Jove_content"> Настройки камеры (время интегрирования, усиления электронный умножитель, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорости считывания описано в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, дающих наилучший компромисс между отношением сигнал-шум, динамический диапазон и временным разрешением. Они должны быть повторно отрегулировано для различных экспериментов, или если разные аппаратные средства используются. Число кадров должны быть достаточно высокими, чтобы гарантировать, что большинство доноров молекул хлорной извести в течение времени наблюдения.

Для измерений на флуоресцентным спектрометром (разделы 7 до 9) хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектрального разрешения записанных данных должен быть найден. С этой целью прорези в возбуждения и эмиссии пути флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого прибора и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод Fast-NPS анализа для получения структурной информации о временной или динамической MACROMolecular комплексы. NPS был применен, чтобы раскрыть путь нити ДНК нешаблонном и положение факторов инициации транскрипции в архей РНК-полимеразы открытого комплекса. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояния, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный вновь внедренной двигателя выборки (Eilert, Т., Beckers, М., Drechsler, Ф., и Михаэлис, J. в процессе подготовки), сокращает время , необходимое для анализа этого сложного smFRET сети по ≈2 порядков величины, по сравнению с оригинальным методом глобального NPS ^27. Надежность такого алгоритма коренится в пробника Метрополис-в-Гиббса в сочетании с параллельной схеме закаливания. Быстро NPS показывает точную воспроизводимость результатов сети и согласуется с результатами ранее опубликованных ^30.

Существует несколько методов, были опубликованы прицельно вывести структурную информацию из измерений smFRET ¹¹ </s^вверх>, ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель краситель. Таким образом, красители, которые не отвечают условиям, сделанные соответствующей модели, не могут быть использованы или привести к ложному структурной информации. Быстро NPS, наоборот, позволяет выбрать для каждой молекулы красителя другой модели. Это помогает объяснить различных конформационных поведение обоих, молекулы красителя сама, а также использовали линкер для его прикрепления. Местные молекулярные окрестности молекулы красителя, а также его физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящим.

За анализируемый smFRET сети архей комплекса инициации, изотропный предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению Iп размер надежных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим положением в среднем для всех молекул красителя медиану всех вероятных размеров объема (на 95%) снижает до менее 0,5 нм ^3. Однако, эти молекулы красителя апостериорные больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая, что допущения сделаны привести к ложному структурной информации. В противоположность этому, апостериорные, определяемые в классической модели согласуются с определенной эффективностью smFRET.

В предположении изотропного и / или динамической позиции в среднем для всех красителей привести к противоречиям, Fast-NPS позволяет молекулы красителя априорные, в которой каждый краситель может быть назначен один из пяти моделей. Каждая модель использует тот же самый доступный объем. Алгоритм расчета AVs красителя делает несколько предположений. Во-первых, пространственная форма Флуорофор является аппроксимируется сферой. Таким образом, диаметр принимая во внимание WID Флуорофор вй, высота и толщина должна быть использована (раздел 12). Кроме того, форма компоновщика аппроксимируется с помощью гибкого стержня. Значения, приведенные в разделе 12 были рассчитаны для красителя Alexa 647, присоединенной через 12-C линкера. На сегодняшний день не представляется возможным точно определить априорно, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрии эксперимента, и, таким образом, все модели должны быть проверены. В общем, будет выбрать модель, которая дает наименьший возможный размер задней, в то же время в соответствии с данными. Для того, чтобы проверить, согласуется ли с данными smFRET выбор моделей, вычисляем как задний и вероятность. Согласованность означает, что более чем 90% образцов, собранных из задней находятся в пределах 95% доверительного интервала вероятности.

Хотя это правда, что нижняя анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET геометрические расположения молекул красителя также должны быть приняты во внимание. Таким образом, в то время как гepresenting молекулы красителя с низкой анизотропии флуоресценции с моделью ИСО является типичным первым выбором, тест консистенция обеспечивает более прямые средства для выбора модели правильного красителя. Оптимальный выбор моделей красителя может привести к резкому увеличению локализации точности и в то же время сохранить согласованность сети с ее FRET данных.

Подводя итог, Fast-NPS позволяет получить структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексов. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или крио электронной микроскопии это позволяет наблюдение за высокоэластичных или переходных комплексов, тем самым значительно расширяя наше механистического понимания сложных биологических процессов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

References

Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics – a primer. J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).
Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

Automatically Generated