معلومات الهيكلية من جزيء واحدة الحنق التجارب باستخدام سريع نانو لتحديد المواقع نظام
Summary
We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.
Abstract
Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.
Introduction
تحديد بنية جزيء حيوي هو شرط أساسي لفهم وظيفتها. طريقتين راسخة لتحديد هيكل هي المجهري البرد الإلكترون والأشعة السينية البلورات 1 و 2. اليوم، توفر كلتا الطريقتين عالية الدقة المعلومات الهيكلية مع قرار وصولا الى مستوى انجستروم. وقد استخدمت هذه الأساليب اثنين على نطاق واسع لتوضيح بنية الجزيئات الحيوية الكبيرة مثل المجمعات البروتين. على الرغم من أن الطرق الحالية وباستمرار قد تحسنت خلال العقود الماضية، وتعقيد الهياكل البيولوجية لا يزال يشكل تحديا كبيرا بالنسبة لعلم الأحياء الهيكلي، لا سيما عندما يتم التحقيق في المجمعات الكبيرة، ودينامية وعابرة 3.
من أجل دراسة ديناميكية الجزيئات المجمعات والعلاقة بين الهيكل وظيفة على وجه الخصوص، منهجيات جزيء واحد لها الأقليمعيديد معلومات مفيدة 4. وقد وضعت عدة استراتيجيات جديدة توفر نهجا متعامد على الحصول على المعلومات الهيكلية ودينامية. ومن الأمثلة على ذلك سرعة عالية AFM 5، والتلاعب الميكانيكية 6، مضان توطين المجهري 7، وكذلك جزيء واحد نقل فورستر الرنين الطاقة (smFRET) 8، 9. منذ وقت مبكر جدا على الحنق اصطلح على تسميته حاكما الجزيئي، ويرجع ذلك إلى اعتماد المسافة على مقياس طول الجزيئات الكبيرة الحيوية 10.
تطبيق واحد للاهتمام بشكل خاص من smFRET هو استخدام المعلومات بعد الحصول عليها من القياسات smFRET للاستدلال الهيكلية المعلومات 11، 12، 13، 14، 15 </sup>، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23. نظرا لدقة الوقت قد حان لsmFRET، والموقف من أجزاء متحركة من بنية البروتين يمكن أن يكون موضعيا. ومع ذلك، من أجل انتزاع معلومات كمية من البيانات smFRET المعلمات تصحيح هامة حول جزيئات الصبغة تحتاج إلى أن تحدد خلال قياس 24. مع هذه العوامل التصحيح، ويمكن حساب كفاءة الحنق E الحنق باستخدام الصيغة
،
حيث أنا وأنا وD </s يو بي> هي شدة مضان من الجهات المانحة وجزيء متقبل، على التوالي (انظر الشكل 2). حسابات β-عامل عبر الحديث، وتسرب الانبعاثات المانحة في القناة متقبل ويحسب من قبل
حيث أنا وأنا و'D هي شدة مضان من الجهات المانحة وجزيء متقبل بعد التبييض صورة للجزيء متقبل.
وγ عامل تصحيح الفرق في الكفاءة كشف النسبية في القناتين، وكذلك الاختلاف في العائد مضان الكم من المتبرع وصبغ متقبل. ويتم حسابه من كل أثر الوقت الفردية من قبل
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" fo:text-align="center" sتيل = "مواءمة النصوص: مركز؛">
ملاحظة، أن هذا الوصف يتجاهل الإثارة المباشرة للجزيء متقبل، والتي تصبح أحيانا مهمة ويحتاج إلى تصحيح للكذلك. لتحديد هذه العوامل تصحيح فمن المفيد أن تثير كل من الجهات المانحة وكذلك متقبل في مخطط بالتناوب 25 من أجل التفريق بين التغيرات الصورة المادية وديناميات الهيكلية.
من أجل الحصول على الكفاءات smFRET الكمية ولكن أيضا المعلومات الهيكلية الكمية فحسب، تم إدخال نظام النانو لتحديد المواقع (NPS) في عام 2008 (26). وقد تم اختيار اسم على أساس التشابه لنظام تحديد المواقع العالمي القائم على الأقمار الصناعية (GPS). مصادر القدرة النووية هي تقنية هجينة تجمع بين smFRET والبيانات البلورات الأشعة السينية لتوطين الوظائف صبغة غير معروفة في المجمعات biomacromolecular. جيخدم بنية rystal كإطار مرجعي وتستخدم نتائج smFRET للحصول على معلومات المسافة بين موقف معروف fluorophore (هوائي) وموقف معروف من التركيب البلوري (الأقمار الصناعية). في تجارب متتالية يتم قياس المسافات بين الهوائي والعديد من الأقمار الصناعية ويتم تحديد الموقف من الهوائي عن طريق نظام تحليل دقيق إحصائيا على أساس تقدير المعلمة النظرية الافتراضية. ونتيجة لذلك، يتم احتساب ليس فقط الأكثر ترجيحا موقف الهوائي، ولكن كامل توزيع 3D عدم اليقين، ما يسمى الخلفي، تصور من قبل وحدات التخزين ذات مصداقية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع NPS للسماح لتحليل الشبكات smFRET كاملة 27.
تم استخدام NPS إلى حل عدد من المسائل الهامة في النسخ حقيقية النواة، وهي بالطبع من الحمض النووي المنبع، الحمض النووي غير القالب ومرنا الوليدة داخل استطالة شارك RNA البلمرة الثانيmplex 12، 28، أيضا مما يدل على تأثير بدء النسخ العوامل 26 و الهندسة المعمارية الديناميكية ل-PROMOTOR فتح مجمع 29. وعلاوة على ذلك، تم استخدام مصادر القدرة النووية لتوضيح هيكل archaeal RNA البلمرة مجمع مفتوح 30 وخاصة موقف من بدء النسخ عامل TFE، الذي يربط بشكل تنافسي لنفس الموقع كما عامل النسخ استطالة Spt4 / 5 31.
منذ ذلك الحين، تم نشر عدد من النهج الهيكلية smFRET أساس 15، 18، 21، 23. عند مقارنة أساليب مختلفة الهيكلية smFRET مقرها، يصبح من الواضح أن الدقة الواضحة للطريقة تعتمد بشكل كبير على اختيار معين من نماذج صبغ. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنجزيئات الصبغة قد يحمل السلوك المكاني وتوجهي مختلفة اعتمادا على بيئتهم المحلية.
تحقيقا لهذه الغاية، وقدم سريعة NPS 32. يستخدم سريع NPS خوارزمية أخذ العينات المتقدمة لحد من الأوقات حساب بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، سريعة NPS يسمح احد لإجراء التحليل البنيوي ولكل جزيء صبغ يمكن للمستخدم الاختيار من بين مجموعة من خمسة نماذج صبغ المختلفة التي من شأنها أن يوصف المقبل. النموذج الأكثر محافظة، ودعا الكلاسيكية، ويفترض أن الصبغة تحتل واحدة فقط، ولكن غير معروف، موقف. في هذا الموقف، يمكن للfluorophore تدوير بحرية داخل مخروط، التي يتم تحديدها من المعنيين (التي تعتمد على الوقت) تباين مضان حجمها. توجه مخروط غير معروفة، الأمر الذي يؤدي إلى شكوك كبيرة عند تحويل الكفاءة smFRET قياسها إلى مسافات. في هذا الصدد، وهذا النموذج هو المحافظ، لأنه سوف يؤدي إلى أصغر الدقة مقارنة مع وضع صبغة أخرىليرة سورية. فقط لمسافات قصيرة جدا يجب أن الافتراضات التي وضعتها القيادة النموذج التقليدي لتحديد موقف غير صحيح بشكل ملحوظ. للقيم smFRET نموذجية، والموقف الصحيح ومرفق طيه دائما في حجم مصداقية كبيرة نسبيا.
ومع ذلك، منذ دقة أعلى أمر مرغوب فيه، فمن المهم لتطوير واختبار نماذج صبغ البديلة، التي يمكن أن تساعد على تحسين الدقة. إذا الصبغة تدور أسرع بكثير من عمر البطارية مضان الأصيل، يمكن تطبيق ما يسمى نموذج ايزو. هنا، فإن العامل التوجه κ 2 (حاجة لحساب مميزة الخواص فورستر دائرة نصف قطرها 
ومن المقرر) إلى 2/3. ونتيجة لذلك، وحدات تخزين ذات مصداقية حسابها هي ما يقرب من أوامر من حجم أصغر بالمقارنة مع تلك الموجودة في النموذج التقليدي 32. في حالة أن يتم العثور على fluorophore في بيئة تمكن ليس فقط reori سريعentation، ولكن الحركة السريعة بالإضافة إلى جميع أنحاء حجمه الوصول إليها، يجب استخدام نموذج meanpos-ايزو. في هذا النموذج، وصبغ تحتل فعال واحد فقط الموقف نفسه، حيث يتم احتساب المتوسط المكاني لمن تحويل المسافة متعدد الحدود 15. ينطبق هذا النموذج على سبيل المثال إذا تم توصيل (عادة مسعور) صبغ إلى المنطقة المائية، على سبيل المثال، الحمض النووي. تطبيق النموذج meanpos-ايزو يؤدي إلى مزيد من الانخفاض في حجم وحدات التخزين ذات مصداقية من قبل عامل ما يقرب من اثنين. ومع ذلك، صبغة مرتبطة البروتين قد ربط عكسية لعدة بقع مسعور في حجم الوصول sterically لها (AV). وfluorophore أن يتحول على الفور بين هذه المناطق، ولكن ضمن منطقة واحدة يخضع دوران حر والحركة المحلية بسرعة هو أفضل وصف من قبل نموذج فار-meanpos-ايزو. لوضع مماثل في الذي الصبغة ليست حرة لتدوير فار-meanpos ينطبق النموذج. المزيد د etails على حول هذه النماذج يمكن العثور عليها في موقعنا نشر مؤخرا 32.
وتوفر هذه النماذج بخيار واسع لحساب خصيصا لبيئات مختلفة قد تواجه صبغة وتطبيقها يحسن بحكمة دقة الترجمة لها. في الوجبات NPS كل جزيء صبغ تعلق على موقف محدد يمكن أن تسند إلى نموذج فردي، بحيث يتم السماح الحنق-الشركاء لدينا نماذج مختلفة. وهذا يتيح بلا حدود وثيق لطبيعة النمذجة. ومع ذلك، فمن المهم أن واحد يؤدي الاختبارات الإحصائية صارمة لضمان أن النتيجة التي تم الحصول عليها عن طريق الجمع بين النموذج النهائي لا يزال في اتفاق مع البيانات التجريبية. يتم تضمين هذه الاختبارات في البرنامج سرعة ومصادر القدرة النووية.
من أجل تطبيق سريع NPS على البيانات التجريبية مطلوب قياس (فقط) ثلاث معلمات الإدخال. أولا، صبغ زوج معين الخواص فورستر أنصاف أقطار (/54782/54782eq5.jpg "/>) ويتم تحديدها بعد. لذلك، فإن العائد الكم (QY) من الصبغة المانحة وأطياف الانبعاث مضان المانحة وأطياف امتصاص متقبل تحتاج إلى قياس. ويمكن إجراء هذه القياسات في الجزء الأكبر، وذلك باستخدام مطياف معيار ومقياس الطيف مضان القياسية. لكل زوج، وR 0 ثم يتم احتساب باستخدام PhotochemCAD مجانية، ويمكن استخدامها في تحليل NPS. وعلاوة على ذلك، (الزمان-حل) anisotropies مضان من جزيئات الصبغة تحتاج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الاستقطاب (والوقت) حساسة مضان مطياف. ومع ذلك، وإدخال المعلمات الأكثر أهمية بالنسبة للسرعة وNPS هي الكفاءة smFRET يقاس على إعداد مضان المجهري جزيء واحد، مثل مجموع الداخلية انعكاس مضان المجهر (TIRFM) .
هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على بيانات smFRET وتطبيق سريعة NPS (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم إجراء الإعداد والتجريبية لتحديد بدقة الكفاءات الحنق بين الأصباغ تعلق عبر linkers مرنة لالجزيئات الكبيرة، أي الأحماض النووية و / أو البروتينات.
من أجل ضمان قياسات دقيقة smFRET (القسم 3)، لا بد من استبعاد الهواء من غرفة التدفق في أي وقت أثناء القياس. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن لا تفرط في غرفة التدفق مع fluorophores. وfluorophores يجب أن تكون مفصولة بشكل واضح لضمان التحليل الصحيح. كما smFRET أزواج، والتي لا تظهر تبيض المتبرع يجب أن تستبعد من التحليل، تأكد من أن> 80٪ من الجزيئات في مجال الرؤية وابيض في نهاية الفيلم. لحساب التجانس في العينة β-عامل وγ عامل، تصحيح عبر الحديث والنسبية الكفاءة الكشف عن قناة المانحة ومتقبل، على التوالي، وتحسب لكل الحنق زوج على حدة.
<p class= "jove_content"> يجب تعيين إعدادات الكاميرا (الوقت التكامل، وزيادة مضاعف الإلكترون، وزيادة ما قبل مكبر للصوت ونسبة قراءات وصفها في القسم 3.9) إلى القيم إعطاء أفضل المفاضلة بين إشارة إلى نسبة الضوضاء، مجموعة ديناميكية ووقت القرار. أنها تحتاج إلى إعادة ضبط للتجارب مختلفة أو إذا تم استخدام أجهزة مختلفة. تحتاج أعداد الإطارات لتكون مرتفعة بما يكفي لضمان أن معظم الجهات المانحة الجزيئات التبييض ضمن الوقت المراقبة.للقياسات على مطياف مضان (الأقسام 7-9) حلا وسطا جيدا بين كثافة إشارة والقرار الطيفي من البيانات المسجلة لديها التي يمكن العثور عليها. لتحقيق هذه الغاية الشقوق في الإثارة وانبعاث الطريق من مطياف مضان يجب أن تتكيف تعتمد على الأداة المستخدمة وتركيز العينة.
وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم أسلوب التحليل السريع NPS للحصول على معلومات الهيكلية للmacrom عابرة أو ديناميكيةالمجمعات olecular. وقد تم تطبيق NPS للكشف عن طريق الحمض النووي حبلا غير القالب والموقف من عوامل النسخ الشروع في الحمض النووي الريبي البلمرة مجمع مفتوح archaeal. باستخدام شبكة تضم أكثر من 60 قياسات المسافة مختلفة، وأظهرت أن الوجبات NPS، مجهزة بمحرك أخذ العينات تنفيذها حديثا (Eilert، T.، بيكرز، M.، دريكسلر، F.، وميخائيل، J. قيد الإعداد)، يقلل من الوقت اللازم لتحليل هذه الشبكة smFRET المعقدة التي ≈2 أوامر من حجم، بالمقارنة مع الأصلي طريقة NPS العالمي 27. متجذر قوة الخوارزمية في العينات متروبوليس داخل جيبس جنبا إلى جنب مع خطة هدأ الموازي. يظهر سريع NPS استنساخ الدقيق لنتائج شبكة ويتفق مع النتائج التي نشرت في وقت سابق 30.
وقد نشرت العديد من الطرق المختلفة التي تهدف إلى استنتاج المعلومات الهيكلية من القياسات smFRET 11 </sتصل>، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18. كل من هذه الطرق توفير واحد فقط نموذج صبغ معين. وهكذا، والأصباغ، التي لا تفي الافتراضات التي وضعتها نموذج منها، لا يمكن أن تستخدم أو أن يؤدي إلى المعلومات الهيكلية كاذبة. سريع NPS، على العكس من ذلك، يسمح لتحديد لكل صبغ جزيء نموذجا مختلفا. وهذا يساعد على تمثل السلوك بتكوين مختلفة على حد سواء، جزيء صبغ نفسها، فضلا عن رابط المستخدمة لتمسكه. والمناطق المحيطة بها الجزيئية المحلية للجزيء صبغ، فضلا عن خصائصه الفيزيائية تحديد النموذج الذي هو الأكثر ملاءمة.
لشبكة smFRET تحليلها من مجمع بدء archaeal، وهو افتراض الخواص لجميع جزيئات الصبغة يؤدي إلى انخفاض حاد طن حجم وحدات التخزين ذات مصداقية بالمقارنة مع النموذج التقليدي. في توليفة مع موقف ديناميكي المتوسط لجميع صبغ الجزيئات المتوسط من جميع الأحجام حجم موثوقة (في 95٪) يقلل إلى أقل من 0.5 نانومتر 3. ومع ذلك، هذه مؤخرات صبغ جزيء لم تعد تنسجم مع قياسات smFRET بهم، مشيرا إلى أن الافتراضات التي تؤدي إلى المعلومات الهيكلية كاذبة. في المقابل، فإن مؤخرات المحددة في النموذج التقليدي تتفق مع الكفاءات smFRET تحديدها.
كما تولي منصب الخواص و / أو متحركا في المتوسط لجميع الأصباغ يؤدي إلى التضارب، سريعة NPS تمكن مقدمو الاديره صبغ جزيء فيها كل صبغة يمكن تعيين واحد من النماذج الخمسة. يستخدم كل نموذج نفس الحجم للوصول. خوارزمية لحساب الأسهم السعودية صبغ يجعل العديد من الافتراضات. في البداية، وتقريب الشكل المكاني للfluorophore من خلال المجال. وهكذا، فإن قطر مع الأخذ بعين الاعتبار دور المرأة في التنمية وfluorophore لوينبغي أن تستخدم عشر والطول والسمك (المادة 12). وعلاوة على ذلك، تم تقريب شكل رابط من قبل قضيب مرن. تم حساب القيم المعروضة في القسم (12) لصبغ اليكسا 647 المرفقة عن طريق رابط 12-C. حتى الآن، فإنه ليس من الممكن تحديد بدقة مسبقا النموذج الذي هو الأكثر ملاءمة، نظرا لهندسة التجريبية، وبالتالي يجب أن يتم اختبار جميع النماذج. بصفة عامة، فإن للمرء أن يختار النموذج الذي يعطي أصغر حجم ممكن الخلفي، في حين لا تزال متسقة مع البيانات. لاختبار ما إذا كان اختيار النماذج يتسق مع البيانات smFRET، نحسب كل من الخلفي واحتمال. الاتساق يعني أن أكثر من 90٪ من العينات التي تم جمعها من الخلفية تقع ضمن فاصل الثقة 95٪ من احتمال.
ولئن كان صحيحا أن لديهم أقل تباين، وأصغر من عدم اليقين بعد، في شبكة smFRET الترتيبات الهندسية للجزيئات الصبغة أيضا أن تؤخذ بعين الاعتبار. وهكذا، في حين صepresenting جزيئات الصبغة مع انخفاض تباين مضان مع نموذج ايزو هو الخيار الأول نموذجي، يوفر اختبار الاتساق وسيلة أكثر مباشرة لاختيار نموذج صبغ الصحيح. الخيار الأمثل للنماذج الصبغة يمكن أن يؤدي إلى زيادة كبيرة في توطين الدقة، وفي الوقت نفسه تحتفظ الاتساق الشبكة مع البيانات الخاصة به الحنق.
لتلخيص، وسرعة وNPS يسمح للحصول على المعلومات الهيكلية والدينامية للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وعلى النقيض من الطرق الهيكلية المشتركة مثل البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني البرد وهذا يسمح لرصد المجمعات عالية مرنة أو عابرة، مما وسع كثيرا فهمنا الآلية معقدة من العمليات البيولوجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.
Materials
| Flowchamber preparation | |||
| Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
| quartz-glass slides, 76 x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
| coverslips, 60 x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
| detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
| ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
| Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
| (3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
| biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
| Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
| sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
| Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
| Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total internal reflection fluorescence microscope | |||
| Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
| diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
| diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
| dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
| dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
| plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
| plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
| prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
| focussing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
| syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
| 2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
| piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
| IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
| dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
| position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
| water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
| dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
| emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
| emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
| EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
| EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
| Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
| Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
| Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
| Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
| PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
| Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
| Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
| Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
| Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |
References
- Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
- Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
- Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
- Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
- Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
- Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
- Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
- Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
- Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
- Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
- Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
- Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
- Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
- Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics – a primer. J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).
- Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
- Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
- Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
- Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
- Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
- Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
- Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
- Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
- Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).
